本文關(guān)鍵詞：GRK3在雄激素剝奪療法誘導(dǎo)的神經(jīng)內(nèi)分泌型前列腺癌中的作用研究

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【摘要】：前列腺癌是非常常見(jiàn)的男性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤之一,在西方國(guó)家也是最常見(jiàn)的惡性腫瘤,尤其在美國(guó),前列腺癌患者的發(fā)病率仍超過(guò)肺癌,高居第一位。近年來(lái),在我國(guó)前列腺癌患者發(fā)病率逐漸呈增長(zhǎng)趨勢(shì)。前列腺癌由于癥狀隱蔽,至少50%的患者確診時(shí)已為局部晚期腫瘤,治療并預(yù)防轉(zhuǎn)移對(duì)提高生存率尤為重要。轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)也是患者死亡的主要原因。神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞已被公認(rèn)為是正常前列腺管道和腺泡的一個(gè)組成部分。近50%的臨床型前列腺癌有神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞異變。神經(jīng)內(nèi)分泌型前列腺癌(neuroendocrine differentiation of prostate cancer,NEPC),也稱(chēng)為未分化小細(xì)胞癌,是一種高侵襲性前列腺癌的亞型。它可以是原發(fā)性的,但其大多數(shù)來(lái)自前列腺腺癌(Prostate adenocarcinoma,PCA)的晚期并進(jìn)行激素治療之后。神經(jīng)內(nèi)分泌型前列腺癌NEPC不同于前列腺癌PCA,NEPC的特點(diǎn)是存在神經(jīng)內(nèi)分泌(neuroendocrine,NE)細(xì)胞、不表達(dá)雄激素受體(androgen receptor,AR)、不分泌前列腺特異性抗原(prostate specific antigen,PSA),但通常高表達(dá)神經(jīng)內(nèi)分泌標(biāo)志物,如嗜鉻粒蛋白A(chromogranin A,CHGA)嗜鉻粒蛋白B(chromogranin B,CHGB),突觸小泡蛋白,特定神經(jīng)元烯醇酶2(enolase 2,ENO2)。臨床研究表明,患者長(zhǎng)期應(yīng)用雄激素剝奪療法(androgen deprivation therapy,ADT)可誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生神經(jīng)內(nèi)分泌轉(zhuǎn)。因此去勢(shì)抵抗型前列腺癌(castration-resistant prostate cancer,CRPC)的發(fā)生率,可能會(huì)隨著臨床引入雄激素剝奪療法的增加而增加,導(dǎo)致一個(gè)高侵襲性、高轉(zhuǎn)移性的臨床過(guò)程。因此,闡明NEPC發(fā)生的分子機(jī)制以及開(kāi)發(fā)NEPC的靶向治療藥物是目前前列腺癌領(lǐng)域的一個(gè)研究熱點(diǎn)。最新研究表明,人類(lèi)G蛋白耦合受體激酶3(G protein-coupled receptor kinases 3,GRK3)是前列腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移過(guò)程中所必不可少的激酶,促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移過(guò)程。因?yàn)镹EPC是具有高轉(zhuǎn)移性質(zhì)的一種前列腺癌的亞型,因此,我們考慮是否GRK3在前列腺腺癌細(xì)胞的NE分化過(guò)程中是否也發(fā)揮了重要的作用。本研究中,我們通過(guò)無(wú)激素培養(yǎng)誘導(dǎo)前列腺腺癌細(xì)胞LNCa P向NE方向轉(zhuǎn)化,制備了雄激素剝奪療法(Androgen deprivation treatment,ADT)誘導(dǎo)的神經(jīng)內(nèi)分泌型前列腺癌細(xì)胞,命名為t-NEPC(ADT-induced NE differentiated cell line)。并研究了LNCa P向t-NEPC細(xì)胞轉(zhuǎn)化的過(guò)程當(dāng)中蛋白激酶GRK3的作用。該研究的目的是為了NEPC的治療提供新的治療靶點(diǎn)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。目的:制備ADT誘導(dǎo)的神經(jīng)內(nèi)分泌型前列腺癌細(xì)胞,并研究在前列腺腺癌細(xì)胞向神經(jīng)內(nèi)分泌轉(zhuǎn)化的過(guò)程中蛋白激酶GRK3的作用,為NEPC的治療提供新的治療靶點(diǎn)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法:1細(xì)胞培養(yǎng)人類(lèi)前列腺腺癌LNCa P細(xì)胞在含5%的胎牛血清、濃度分別為1%的谷氨酰胺和1%的青霉素和鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)液中培養(yǎng)。t-NEPC細(xì)胞在含5%的無(wú)激素胎牛血清、濃度分別為1%的谷氨酰胺和1%的青霉素和鏈霉素的無(wú)激素RPMI1640培養(yǎng)液中培養(yǎng)。2實(shí)驗(yàn)方法采用無(wú)激素RPMI1640培養(yǎng)基誘導(dǎo)人類(lèi)前列腺腺癌LNCa P細(xì)胞向神經(jīng)內(nèi)分泌方向轉(zhuǎn)化,成功制備人前列腺腺癌細(xì)胞來(lái)源的神經(jīng)內(nèi)分泌t-NEPC細(xì)胞,采用Real time PCR檢測(cè)兩種細(xì)胞當(dāng)中PSA、AR以及NE標(biāo)志物CHGA、CHGB和ENO2的表達(dá)變化,通過(guò)Real time PCR和western blot方法檢測(cè)兩種細(xì)胞中GRK3的表達(dá)變化。采用病毒感染方法建立穩(wěn)定表達(dá)sh GRK3的t-NEPC細(xì)胞,并采Real time PCR方法檢測(cè)敲低GRK3后t-NEPC細(xì)胞中NE標(biāo)志物CHGA、CHGB和ENO2的表達(dá)變化。結(jié)果:1 ADT可誘導(dǎo)人類(lèi)前列腺腺癌LNCa P細(xì)胞向神經(jīng)內(nèi)分泌方向分化首先我們通過(guò)在去激素的RPMI1640,含5%的胎牛血清、濃度分別為1%的谷氨酰胺和1%的青霉素和鏈霉素的培養(yǎng)基中,長(zhǎng)期培養(yǎng)LNCa P細(xì)胞從而得到t-NEPC細(xì)胞。這些細(xì)胞是來(lái)源于長(zhǎng)期用ADT治療的人類(lèi)前列腺腺癌LNCa P細(xì)胞。結(jié)果顯示,LNCa P細(xì)胞顯示上皮形態(tài),而t-NEPC細(xì)胞可見(jiàn)包體變圓,周?chē)霈F(xiàn)很多神經(jīng)元樣細(xì)胞突觸,細(xì)胞形態(tài)發(fā)生了變化。我們又通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR在LNCa P和t-NEPC這兩個(gè)細(xì)胞系中比較AR的表達(dá)以及其目標(biāo)基因前列腺特異性抗原(PSA)兩種NE標(biāo)記物的表達(dá)。結(jié)果顯示,PSA在LNCa P細(xì)胞中的表達(dá)比在t-NEPC細(xì)胞中高出10倍,AR在LNCa P細(xì)胞比在t-NEPC胞中的表達(dá)也高出了5倍,在LNCa P細(xì)胞中CHGA上升了6倍,CHGB上升了4倍,ENO2上升了20倍。2 GRK3在人類(lèi)前列腺腺癌向神經(jīng)內(nèi)分泌方向分化的表達(dá)變化我們研究了GRK3在LNCa P和t-NEPC細(xì)胞中的表達(dá)。Western-blot結(jié)果顯示與LNCa P細(xì)胞相比GRK3在ADT-誘導(dǎo)的t-NEPC細(xì)胞中的蛋白水平明顯升高;而通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)結(jié)果顯示,ADT-誘導(dǎo)的t-NEPC細(xì)胞與LNCa P細(xì)胞相比顯著上升了兩倍.3敲除GRK3后對(duì)t-NEPC表型的影響我們用GRK3 sh RNA感染t-NEPC細(xì)胞后,首先觀察了細(xì)胞的形態(tài)變化,細(xì)胞轉(zhuǎn)染GRK3 sh RNA后,細(xì)胞觸角減少,形態(tài)發(fā)生逆轉(zhuǎn)變化,然后我們又通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR方法檢測(cè)了t-NEPC shscramble和t-NEPC sh GRK3以此評(píng)估敲除GRK3實(shí)驗(yàn)是否成功,結(jié)果顯示:t-NEPC sh GRK3組的表達(dá)明顯低于對(duì)照組t-NEPC shscramble 3倍,GRK3 sh RNA被感染成t-NEPC細(xì)胞減少了內(nèi)源性GRK3,GRK3敲除成功。我們進(jìn)一步進(jìn)行了NE標(biāo)志物:CHGA CHGB和ENO2的表達(dá),通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR分析t-NEPC sh GRK3較對(duì)照組t-NEPC shscramble的NE標(biāo)志物的表達(dá)明顯下降。結(jié)論:1 ADT可誘導(dǎo)人類(lèi)前列腺腺癌LNCa P細(xì)胞向神經(jīng)內(nèi)分泌方向分化。2 GRK3促進(jìn)了人類(lèi)前列腺腺癌向神經(jīng)內(nèi)分泌方向分化。3敲低GRK3后t-NEPC表型發(fā)生了逆轉(zhuǎn)變化,NE標(biāo)記物CHGA、CHGB和ENO2的表達(dá)均明顯下降。
【關(guān)鍵詞】：GRK3 誘導(dǎo) 分化 t-NEPC 神經(jīng)內(nèi)分泌型前列腺癌
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：R737.25
【目錄】：

• 中文摘要4-7
• 英文摘要7-11
• 前言11-12
• 材料與方法12-18
• 結(jié)果18-20
• 附圖20-25
• 討論25-27
• 結(jié)論27-28
• 參考文獻(xiàn)28-33
• 綜述 前列腺癌神經(jīng)內(nèi)分泌化的研究進(jìn)展33-41
• 參考文獻(xiàn)37-41
• 致謝41-42
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷42

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中國(guó)碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 張小沖;GRK3在雄激素剝奪療法誘導(dǎo)的神經(jīng)內(nèi)分泌型前列腺癌中的作用研究[D];河北醫(yī)科大學(xué);2015年

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本文編號(hào)：636912