本文關(guān)鍵詞：新型融合蛋白Pro-SIRPα的構(gòu)建及生物學(xué)活性研究

  更多相關(guān)文章： SIRPα CD47 封閉肽 高親和力突變體 pro-SIRPα

【摘要】：跨膜糖蛋白CD47,屬于免疫球蛋白超家族的一種跨膜蛋白,廣泛表達(dá)于多組織細(xì)胞表面,如紅細(xì)胞、血小板、淋巴細(xì)胞、肝細(xì)胞及腫瘤細(xì)胞等。其生理功能多樣,參與細(xì)胞與胞外基質(zhì)的相互作用,與細(xì)胞凋亡、增殖、遷移等細(xì)胞學(xué)過程關(guān)系密切并且參與腫瘤免疫逃逸的機(jī)制。目前,CD47這一靶點(diǎn)已用于研究治療多種疾病如白血病、非霍奇金氏淋巴瘤、骨髓瘤及其他實(shí)體瘤。信號調(diào)節(jié)蛋白α(SIRPα,signal regulatory protein-α),作為免疫球蛋白超家族膜蛋白的成員之一,是SIRP家族中一個典型的抑制性受體。其特異性的表達(dá)于髓系細(xì)胞如巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞,以及神經(jīng)細(xì)胞膜表面。CD47是SIRPα的天然配體,CD47-SIRPα信號通路在多種生理機(jī)制中發(fā)揮作用。其中,以在體內(nèi)巨噬細(xì)胞吞噬過程中發(fā)揮的作用為最有特征性的。當(dāng)巨噬細(xì)胞表面的SIRPα在與腫瘤細(xì)胞表面的CD47分子結(jié)合后,會介導(dǎo)“Don’t eat me”的信號,使腫瘤細(xì)胞免于巨噬細(xì)胞的吞噬,發(fā)生免疫逃逸,進(jìn)而導(dǎo)致腫瘤進(jìn)展。然而,在正常血液系統(tǒng)細(xì)胞表面也會有少量的CD47表達(dá),CD47-SIRPα信號通路參與紅細(xì)胞吞噬過程的調(diào)節(jié),也一定程度上參與血小板及淋巴細(xì)胞的調(diào)節(jié)。因而,傳統(tǒng)的抗CD47抗體類藥物都會引起一定程度的血液系統(tǒng)副作用,從而影響靶向CD47抗體藥物的臨床應(yīng)用前景。針對這一問題,本研究構(gòu)建了可在腫瘤部位特異性釋放封閉肽的高親和力新型融合蛋白pro-SIRPα,并對其生物學(xué)活性進(jìn)行了研究。首先利用噬菌體表面展示肽庫技術(shù)篩選得到與突變型信號調(diào)節(jié)蛋白SIRPα-cv1活性區(qū)特異性結(jié)合的短肽(12肽),作為封閉肽(masking peptide)降低SIRPα-cv1與CD47的結(jié)合親和力,從而減少SIRPα-cv1與非腫瘤部位的CD47結(jié)合的可能,減少“抗原沉默”(antigen sink effect)現(xiàn)象的發(fā)生。然后,通過含有尿激酶(uPA)酶切位點(diǎn)的柔性多肽linker將封閉肽連接在SIRPα-cv1融合蛋白的氨基末端(N-端),構(gòu)建為完整的pro-SIRPα。在腫瘤微環(huán)境下,linker在uPA酶的作用下水解,釋放前端短肽,暴露pro-SIRPα與CD47的結(jié)合位點(diǎn),從而起到競爭性結(jié)合CD47的作用,有效抑制腫瘤的進(jìn)展。體外實(shí)驗中,本研究通過競爭ELISA驗證了pro-SIRPα前端封閉肽是否具有封閉效應(yīng)。實(shí)驗結(jié)果表明:由于氨基端封閉肽的存在,pro-SIRPα與CD47的結(jié)合能力顯著下降。而用腫瘤微環(huán)境中富含的uPA酶水解后,pro-SIRPα氨基末端的linker斷裂,使得封閉肽脫離并暴露出完整的SIRPα-cv1,恢復(fù)與CD47的結(jié)合能力。因此,由于封閉肽的存在,新型融合蛋白pro-SIRPα對腫瘤組織的特異性得到了明顯的提高,減少了其與正常血液系統(tǒng)細(xì)胞的結(jié)合,降低了潛在的血液毒性以及可能引起的抗原沉默(antigen sink effect)現(xiàn)象。此外,本研究還證實(shí),與單獨(dú)應(yīng)用抗EGFR的單抗相比,uPA處理后的pro-SIRPα與抗EGFR-單抗聯(lián)用可顯著增強(qiáng)巨噬細(xì)胞對A431腫瘤細(xì)胞的吞噬作用。靶向阻斷腫瘤部位的CD47-SIRPα信號通路,可有效促進(jìn)巨噬細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的吞噬作用。而pro-SIRPα的研制可能為腫瘤靶向治療提供新的策略。
【關(guān)鍵詞】：SIRPα CD47 封閉肽 高親和力突變體 pro-SIRPα
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R73-36
【目錄】：

• 摘要7-9
• Abstract9-11
• 縮略詞表11-13
• 前言13-15
• 一、新型融合蛋白pro-SIRPα的設(shè)計15-34
• （一）酶聯(lián)免疫吸附法篩選噬菌體表面展示肽庫15-29
• 1、實(shí)驗材料15-16
• 2、實(shí)驗方法16-25
• 3、實(shí)驗結(jié)果25-28
• 4、討論28-29
• （二）競爭性ELISA法篩選具有競爭性結(jié)合能力的12肽29-34
• 1、實(shí)驗材料29
• 2、試驗方法29-30
• 3、實(shí)驗結(jié)果30-32
• 4、討論32-34
• 二、新型融合蛋白pro-SIRPα的構(gòu)建表達(dá)34-58
• （一）重組表達(dá)載體的構(gòu)建、酶切鑒定和測序34-48
• 1、實(shí)驗材料34-35
• 2、試驗方法35-43
• 3、實(shí)驗結(jié)果43-47
• 4、討論47-48
• （二）重組蛋白的表達(dá)，酶切與純化48-58
• 1、實(shí)驗材料48-49
• 2、試驗方法49-55
• 3、實(shí)驗結(jié)果55-57
• 4、討論57-58
• 三、新型融合蛋白pro-SIRPα的體外活性研究58-66
• （一）競爭性ELISA驗證與CD47的親和性58-63
• 1、實(shí)驗材料58
• 2、試驗方法58-60
• 3、實(shí)驗結(jié)果60-61
• 4、討論61-63
• （二）pro-SIRPα聯(lián)用抗EGFR-IgG1單抗的腫瘤細(xì)胞吞噬實(shí)驗63-66
• 1、實(shí)驗材料63
• 2、試驗方法63-64
• 3、實(shí)驗結(jié)果64-65
• 4、討論65-66
• 總結(jié)66-67
• 參考文獻(xiàn)67-72
• 文獻(xiàn)綜述 CD47-SIRPα信號通路在吞噬功能及免疫系統(tǒng)領(lǐng)域的研究進(jìn)展72-85
• 一、SIRPα與CD47的簡介72-73
• （一）SIRPα簡介72
• （二）CD47簡介72-73
• 二、CD47-SIRPα信號通路的功能73-77
• （一）調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的吞噬作用73-76
• 1、對成熟紅細(xì)胞的吞噬作用73-74
• 2、對移植造血干細(xì)胞的吞噬作用74-75
• 3、對腫瘤細(xì)胞的吞噬作用75-76
• （二）調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)的作用76-77
• 1、調(diào)節(jié)樹突狀細(xì)胞及T細(xì)胞在次級淋巴器官中的平衡76-77
• 2、調(diào)節(jié)自身免疫性疾病的進(jìn)展77
• 三、結(jié)語77-79
• 參考文獻(xiàn)79-85
• 在讀期間發(fā)表論文和參加科研工作情況說明85-86
• 致謝86

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