本文關(guān)鍵詞：重組溶瘤痘病毒的構(gòu)建及對胰腺癌細(xì)胞的體外殺傷作用

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【摘要】：早在一個(gè)世紀(jì)前已嘗試使用病毒治療腫瘤。溶瘤病毒是指能夠靶向性地殺傷腫瘤細(xì)胞卻不傷害正常細(xì)胞組織的病毒。同時(shí),溶瘤病毒對目前使用的抗腫瘤療法不產(chǎn)生拮抗作用,比較適合聯(lián)合用藥。目前常對痘苗病毒進(jìn)行基因改造,構(gòu)建靶向性強(qiáng)、溶瘤性強(qiáng)且安全性強(qiáng)的溶瘤痘病毒。本研究分兩部分,分述如下：第一部分重組溶瘤痘病毒vvDD-GFP-DsRed的構(gòu)建及對胰腺癌細(xì)胞的體外殺傷作用目的成功構(gòu)建胸苷激酶(thymidine kinase, TK)和痘苗生長因子(vaccinia growth factor, VGF)雙基因缺失同時(shí)又表達(dá)紅色熒光蛋白DsRed和綠色熒光蛋白GFP的溶瘤痘病毒,并且研究其在體外對胰腺癌細(xì)胞BxPC-3和Patu8988的殺傷效果。方法利用同源重組法在痘病毒TK基因處插入DsRed基因和GFP基因,并將其克隆入缺失VGF基因的VSC20病毒,成功構(gòu)建VGF和TK雙基因缺失的重組溶瘤痘病毒vvDD-GFP-DsRed。使用CCK-8法和結(jié)晶紫空斑染色法檢測重組病毒在體外對胰腺癌細(xì)胞BxPC-3口P atu8988的殺傷效果。結(jié)果利用同源重組法和軟瓊脂篩選法獲取高純度重組溶瘤痘病毒vvDD-GFP-DsRed。CCK-8法結(jié)果顯示,感染重組病毒vvDD-GFP-DsRed后的BxPC-3細(xì)胞和Patu8988田胞存活率與MOI值和時(shí)間成負(fù)相關(guān)(P均0.05)；與MOI=0比較,Patu8988細(xì)胞在MOI=0.01時(shí)存活率低(P0.05)且在結(jié)晶紫空斑染色法中形成了較為明顯的空斑。結(jié)論成功構(gòu)建了重組溶瘤痘病毒vvDD-GFP-DsRed,其對BxPC-3細(xì)胞和Patu8988田胞均有明顯的殺傷效果。第二部分重組溶瘤痘病毒vvDD-EphA2xCD3-DsRed的構(gòu)建及對胰腺癌細(xì)胞的體外殺傷作用目的成功構(gòu)建攜帶EphA2xCD3雙特異性抗體,同時(shí)表達(dá)DsRed的VGF和TK雙基因缺失的溶瘤痘病毒,并且研究其在體外介導(dǎo)PBMC細(xì)胞對胰腺癌細(xì)胞BxPC-3和Patu8988的殺傷效果。方法利用同源重組法在痘病毒TK基因處插入EphA2xCD3雙特性抗體和DsRed基因,并將其克隆入缺失VGF基因的VSC20病毒,成功構(gòu)建攜帶EphA2xCD3雙特異性抗體,同時(shí)表達(dá)DsRed的VGF和TK雙基因缺失的重組溶瘤痘病毒vvDD-EphA2xCD3-DsRed。用RT-PCR法檢測EphA2在BxPC-3細(xì)胞和Patu8988細(xì)胞中的表達(dá)量；采用CCK-8法和結(jié)晶紫空斑染色法檢測重組病毒介導(dǎo)PBMC細(xì)胞在體外對胰腺癌細(xì)胞BxPC-3和Patu8988的殺傷效果,同時(shí)用ELISA試劑盒檢測收集MOI分別為1,0.1的24 h、48 h、72 h含PBMC細(xì)胞組的上清液中IL-2及IFN-γ的表達(dá)量。結(jié)果利用同源重組法和軟瓊脂篩選法獲取高純度重組溶瘤痘病毒vvDD-EphA2xCD3-DsRed。EphA2在BxPC-3細(xì)胞和Patu8988細(xì)胞中均高表達(dá)。CCK-8法結(jié)果顯示,感染重組病毒vvDD-EphA2xCD3-DsRed后的BxPC-3細(xì)胞和Patu8988細(xì)胞存活率與MOI值和時(shí)間成負(fù)相關(guān)(P均0.05)；與不含PBMC細(xì)胞組相比,感染含PBMC細(xì)胞的vvDD-EphA2xCD3-DsRed后BxPC-3細(xì)胞和Patu8988田胞存活率較低(P均0.05)。與MOI=0比較,Patu8988田胞在MOI=001時(shí)存活率低(P0.05)且在結(jié)晶紫空斑染色法中形成了較為明顯的空斑。ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,PBMC細(xì)胞與Patu8988細(xì)胞共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中,感染wDD-EphA2xCD3-DsRed的PBMC細(xì)胞表達(dá)IL-2和IFN-y,而感染vvDD-GFP-DsRed的PBMC細(xì)胞則不表達(dá)IL-2口IFN-γ。結(jié)論成功構(gòu)建了重組溶瘤痘病毒vDD-EphA2xCD3-DsRed,其對BxPC-3細(xì)胞和Patu8988田胞均有明顯的殺傷效果,且加入PBMC田胞后明顯增強(qiáng)重組病毒vvDD-GFP-DsRed對BxPC-3田胞和Patu8988細(xì)胞的殺傷作用。
【關(guān)鍵詞】：溶瘤痘病毒 vvDD-GFP-DsRed 胰腺癌 溶瘤痘病毒 vvDD-EphA2xCD3-DsRed PBMC 胰腺癌
【學(xué)位授予單位】：江蘇大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R735.9
【目錄】：

• 摘要5-8
• ABSTRACT8-13
• 英文縮略詞表13-14
• 第一章 前言14-18
• 1.1 研究背景14-16
• 1.2 本研究的內(nèi)容及技術(shù)路線16-18
• 1.2.1 本研究的內(nèi)容16
• 1.2.2 本研究的技術(shù)路線16-18
• 第二章 重組溶瘤痘病毒vvDD-GFP-DsRed的構(gòu)建及對胰腺癌細(xì)胞的體外殺傷作用18-39
• 2.1 材料18-21
• 2.1.1 質(zhì)粒、病毒和菌株18
• 2.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑18-19
• 2.1.3 主要溶液配制19
• 2.1.4 主要實(shí)驗(yàn)儀器19-20
• 2.1.5 引物序列設(shè)計(jì)20-21
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法21-31
• 2.2.1 質(zhì)粒pSEL2N1-GFP-DsRed的構(gòu)建21-26
• 2.2.2 貼壁細(xì)胞培養(yǎng)26-28
• 2.2.3 痘苗病毒與重組質(zhì)粒同源重組28-29
• 2.2.4 重組溶瘤痘病毒的空斑篩選和純化29
• 2.2.5 重組病毒病毒滴度測定29-30
• 2.2.6 重組溶瘤痘病毒的殺傷性檢測30-31
• 2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理31
• 2.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果31-38
• 2.4.1 重組病毒構(gòu)建示意圖31
• 2.4.2 目的片段的PCR擴(kuò)增31-32
• 2.4.3 重組質(zhì)粒PCR鑒定結(jié)果32-33
• 2.4.4 重組病毒熒光顯微鏡下驗(yàn)證結(jié)果33-34
• 2.4.5 重組病毒的滴度測定結(jié)果34
• 2.4.6 重組病毒的殺傷性檢測結(jié)果34-38
• 2.5 討論38-39
• 第三章 重組溶瘤痘病毒vvDD-EphA2xCD3-Ds Red的構(gòu)建及對胰腺癌細(xì)胞的體外殺傷作用39-65
• 3.1 材料39-40
• 3.1.1 質(zhì)粒、病毒和菌株39
• 3.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑39
• 3.1.3 主要溶液配制39
• 3.1.4 主要實(shí)驗(yàn)儀器39
• 3.1.5 引物序列設(shè)計(jì)39-40
• 3.2 實(shí)驗(yàn)方法40-52
• 3.2.1 質(zhì)粒pSEL2N1-EphA2xCD3-DsRed的構(gòu)建40-45
• 3.2.2 懸浮細(xì)胞培養(yǎng)45-47
• 3.2.3 RT-PCR檢測胰腺癌細(xì)胞中EphA2 mRNA表達(dá)47-49
• 3.2.4 痘苗病毒與重組質(zhì)粒同源重組49
• 3.2.5 重組溶瘤痘病毒的空斑篩選和純化49-50
• 3.2.6 重組病毒病毒滴度測定50
• 3.2.7 重組溶瘤痘病毒的殺傷性檢測50-51
• 3.2.8 ELISA試驗(yàn)51-52
• 3.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理52
• 3.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果52-62
• 3.4.1 重組病毒構(gòu)建示意圖52
• 3.4.2 目的片段的PCR擴(kuò)增52-53
• 3.4.3 重組質(zhì)粒PCR鑒定結(jié)果53-54
• 3.4.4 重組病毒熒光顯微鏡下驗(yàn)證結(jié)果54-55
• 3.4.5 EphA2 RNA在胰腺癌細(xì)胞中的表達(dá)55-56
• 3.4.6 重組病毒的滴度測定結(jié)果56
• 3.4.7 重組病毒的殺傷性檢測結(jié)果56-61
• 3.4.8 ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果61-62
• 3.5 討論62-65
• 第四章 總結(jié)和工作展望65-66
• 4.1 總結(jié)65
• 4.2 工作展望65-66
• 參考文獻(xiàn)66-70
• 綜述70-86
• 參考文獻(xiàn)77-86
• 致謝86-87
• 攻讀碩士期間發(fā)表的論文87

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本文編號：628820