本文關(guān)鍵詞：循環(huán)miRNA內(nèi)參的篩選及驗證

  更多相關(guān)文章： 循環(huán)mi RNA 內(nèi)參基因 腫瘤 q-PCR 歸一化

【摘要】：[目的]通過對不同腫瘤患者和健康對照者血清中微小RNA(micro RNA,mi RNA)表達情況進行檢測,并在血漿樣本中進行驗證,篩選出表達穩(wěn)定、檢測方便、適合作為內(nèi)參的循環(huán)mi RNA,為循環(huán)mi RNA腫瘤標(biāo)志物的篩選及后續(xù)研究提供可靠的內(nèi)參基因。[方法]采用高通量微陣列芯片技術(shù),分別對20例鼻咽癌(Nasophary ngeal cancer,NPC)患者,20例健康對照血清,10例胃癌(Gastric Cancer,GC)患者、10例健康對照血清等體積混合后,對混合血清中mi RNA表達譜進行分析,結(jié)合大量文獻數(shù)據(jù),篩選出其中表達水平較高、穩(wěn)定性較好的mi RNA作為候選循環(huán)mi RNA內(nèi)參。采用實時熒光定量PCR技術(shù),在上述30例腫瘤患者和30例健康對照者血清中對初步篩選出的mi RNA的表達水平進行驗證,同時對U6和mi R-16作為內(nèi)參的適用性進行分析,并利用Ge Norm軟件對候選內(nèi)參基因分子進行計算分析,排除部分表達水平較低或者表達穩(wěn)定性較差的循環(huán)mi RNA后,得到表達最穩(wěn)定mi RNA。另選取50例健康人及178例腫瘤患者(胃癌68例、結(jié)腸癌(Colon Cancer)、直腸癌(Rectal Cancer)、乳腺癌(Breast Cancer,BC)各30例、鼻咽癌20例)血清,采用實時熒光定量PCR(quantitative real-time polymerase chain reaction,q PCR)技術(shù)對初篩的內(nèi)參基因表達水平進行驗證;結(jié)合Ge Norm軟件、Norm Finder軟件、Best Keeper軟件進行綜合分析計算,驗證所篩選內(nèi)參基因的可靠性及穩(wěn)定性。進一步驗證所篩選內(nèi)參基因在不同凍融次數(shù)下表達穩(wěn)定性。在血漿中對篩選的循環(huán)mi RNA內(nèi)參的表達穩(wěn)定性進行驗證。[結(jié)果]高通量微陣列芯片結(jié)果顯示,在鼻咽癌、胃癌和健康對照者組血清中,經(jīng)初步篩選其中共有6個mi RNA符合內(nèi)參篩選要求,分別為hsa-mi R-191-5p,hsa-mi R-24-3p,hsa-mi R-142-3p,hsa-mi R-186-5p,hsa-mi R-135a*-3p,hsa-mi R-19b-3p。根據(jù)鼻咽癌與非癌人群的mi RNA表達譜芯片分析和實時熒光定量PCR發(fā)現(xiàn)U6在不同人群中表達存在較大波動,反復(fù)凍融后表達量亦有所降低,證實了U6不適合作為循環(huán)mi RNA內(nèi)參。經(jīng)初次q PCR驗證hsa-mi R-135a*-3p基因表達水平CV值(cycle value,CV)(也叫CT值)中位數(shù)大于35被排除,剩余的5個mi RNA被納入進一步分析。應(yīng)用Ge Norm軟件對上述5個候選內(nèi)參基因穩(wěn)定性進行計算分析,結(jié)合其在不同樣本中的表達水平,初步篩選出可能的mi RNA內(nèi)參基因為hsa-mi R-191-5p,hsa-mi R-24-3p,hsa-mi R-142-3p。經(jīng)一定量的樣本再次q PCR驗證初篩的mi RNA內(nèi)參和文獻報道的可能的循環(huán)mi RNA內(nèi)參,結(jié)合Ge Norm軟件、Norm Finder軟件、Best Keeper軟件進行綜合分析計算,結(jié)果證實mi R-191和mir-24的表達最為穩(wěn)定,優(yōu)于文獻報道的其他候選循環(huán)mi RNA內(nèi)參。在血清反復(fù)凍融情況下,mi R-191和mir-24表達較為穩(wěn)定。mi R-191和mir-24在血漿樣品中表達同樣比較穩(wěn)定,提示其同樣適用于作為血漿mi RNA的內(nèi)參。[結(jié)論]U6不適合作為循環(huán)mi RNA內(nèi)參;hsa-mi R-191-5p和has-mi R-24-3p適合作為循環(huán)mi RNA內(nèi)參。
【關(guān)鍵詞】：循環(huán)mi RNA 內(nèi)參基因 腫瘤 q-PCR 歸一化
【學(xué)位授予單位】：南華大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R730.43
【目錄】：

• 摘要4-7
• Abstract7-12
• 第1章 緒論12-18
• 第2章 實驗材料18-22
• 2.1 主要實驗儀器18
• 2.2 主要實驗試劑及材料18-20
• 2.3 溶液的配制20-22
• 第3章 實驗方法22-30
• 3.1 血液樣本的收集22
• 3.2 血清總RNA的提取、純化22-24
• 3.3 逆轉(zhuǎn)錄24-25
• 3.4 高通量微陣列芯片檢測血清miRNA表達譜25-26
• 3.5 引物的設(shè)計和合成26-27
• 3.6 實時熒光定PCR27-28
• 3.7 數(shù)據(jù)篩選和統(tǒng)計分析28-30
• 第4章 實驗結(jié)果30-42
• 4.1 收集不同腫瘤患者血清及對照組健康人群血清，完善個人資料和臨床資料，初步建立完善血清樣本庫30-31
• 4.2 U6和miR16作為內(nèi)參的適用性分析31-34
• 4.3 高通量微陣列芯片分析初步篩選候選內(nèi)參mi RNA34
• 4.4 候選內(nèi)參miRNA初步篩選34-36
• 4.5 擴大樣本進一步篩選并驗證循環(huán)miRNA內(nèi)參36-38
• 4.6 凍融次數(shù)對各候選miRNA內(nèi)參基因的影響38-39
• 4.7 篩選出的循環(huán)miRNA內(nèi)參在血漿中進行穩(wěn)定性驗證39-42
• 第5章 討論42-50
• 第6章 結(jié)論50-52
• 參考文獻52-60
• 文獻綜述60-72
• 參考文獻65-72
• 作者攻讀學(xué)位期間的科研成果72-74
• 本研究基金資助項目74-76
• 致謝76-77

【共引文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 Lin Zhu;Xiu-Hua Qu;Yu-Lin Sun;Yang-Ming Qian;Xiao-Hang Zhao;;Novel method for extracting exosomes of hepatocellular carcinoma cells[J];World Journal of Gastroenterology;2014年21期

2 Marco Ragusa;Cristina Barbagallo;Luisa Statello;Angelo Giuseppe Condorelli;Rosalia Battaglia;Lucia Tamburello;Davide Barbagallo;Cinzia Di Pietro;Michele Purrello;;Non-coding landscapes of colorectal cancer[J];World Journal of Gastroenterology;2015年41期

，

本文編號：624527