本文關(guān)鍵詞：食管鱗癌差異表達(dá)蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)分析

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【摘要】：背景:2014年“世界癌癥報(bào)告”報(bào)道,中國每年食管癌(Esophageal Cancer,EC)新增和死亡病例居全球首位,其中90%組織學(xué)上屬于食管鱗狀細(xì)胞癌(Esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)。近20年來,EC患者的總體五年生存率卻無顯著變化,仍徘徊于15%-25%。EC預(yù)后差的主要原因在于多數(shù)病人首次確診時(shí)已發(fā)展至中晚期,并且至少50%病人已有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移發(fā)生。因此,闡明ESCC發(fā)病因素及發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制,篩選鑒定ESCC特異敏感的生物標(biāo)志物,探索新的治療靶點(diǎn)和治療手段,對(duì)降低ESCC發(fā)病率及死亡率具有重要的理論意義及臨床應(yīng)用價(jià)值。蛋白作為生命活動(dòng)的最終承載者,在疾病發(fā)生發(fā)展過程中具有重要的生物學(xué)功能。蛋白與蛋白通過多種方式相互作用而形成復(fù)雜的蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò),參與正常生命活動(dòng)的維系。病理狀態(tài)下,蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)也隨之發(fā)生動(dòng)態(tài)變化。因此,單個(gè)蛋白的改變很難反映機(jī)體的生理或病理狀態(tài),造成單個(gè)異常分子診斷疾病的特異性、敏感性有限。質(zhì)譜、蛋白芯片及生物信息學(xué)技術(shù)的應(yīng)用,使我們能夠從系統(tǒng)生物學(xué)角度理解生命及疾病過程的本質(zhì)。此外,基于質(zhì)譜技術(shù)的蛋白質(zhì)組學(xué)具有重復(fù)性差、樣品依賴度高和蛋白序列覆蓋率低等缺陷。因此,需要尋找另外的方法來彌補(bǔ)這些不足,并同時(shí)提高鑒定低豐度蛋白的可能性。蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)分析不僅能夠提供蛋白質(zhì)分子功能、生物學(xué)通路及過程等信息,還能夠在一定程度上彌補(bǔ)蛋白質(zhì)組學(xué)研究的不足。目的:1應(yīng)用i TRAQ標(biāo)記及質(zhì)譜定量技術(shù)分析ESCC及癌旁形態(tài)學(xué)正常食管黏膜上皮組織差異表達(dá)蛋白譜;2對(duì)上述差異表達(dá)蛋白進(jìn)行基因本體(Gene ontology,GO)富集分析,確定與腫瘤相關(guān)的種子蛋白并繪制種子蛋白與蛋白間相互作用網(wǎng)絡(luò),通過網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)結(jié)構(gòu)分析確定關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)/瓶頸蛋白,并對(duì)其進(jìn)行KEGG通路富集分析;3確定ESCC候選標(biāo)志物纖維連接蛋白(Fibronectin,FN1)、肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白(Transgelin,TAGLN)、整合素β1(Integrinβ1,ITGB1)、14-3-3ζ(YWHAZ)在ESCC中的表達(dá)特征及臨床意義。材料與方法:1分別提取10例ESCC及癌旁組織(來源于林州市腫瘤醫(yī)院)蛋白,Bradford法測(cè)定蛋白濃度,取各例標(biāo)本等量蛋白分別制備ESCC和癌旁組織混合蛋白標(biāo)本,并進(jìn)行i TRAQ標(biāo)記、質(zhì)譜定量分析ESCC相關(guān)蛋白表達(dá)(3次生物重復(fù));根據(jù)平均差異倍數(shù)≥1.2倍及肽段≥2個(gè)確定差異表達(dá)蛋白列表;2應(yīng)用Bin GO對(duì)243個(gè)差異表達(dá)蛋白進(jìn)行GO功能富集分析,選取與腫瘤十大特征相關(guān)的117個(gè)蛋白為種子蛋白,搜尋STRING(http://www.string-db.org/)數(shù)據(jù)庫中構(gòu)建蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò);應(yīng)用HUBBA網(wǎng)站(http://hub.iis.sinica.edu.tw/Hubba/index.php)中“度(DEGREE)”和“瓶頸(BOTTLE NECK)”算法分析蛋白網(wǎng)絡(luò)的節(jié)點(diǎn)蛋白和瓶頸蛋白,并選取大于得分均值的蛋白為關(guān)鍵蛋白,Clue GO分析關(guān)鍵蛋白的KEGG通路特征;根據(jù)癌蛋白緊臨及協(xié)同作用原則,由關(guān)鍵蛋白確定ESCC候選蛋白。3應(yīng)用Western blot方法分析ESCC候選蛋白在ESCC組織中的表達(dá):配制積層膠和分離膠,取等量癌與癌旁組織蛋白分別混合SDS上樣緩沖液進(jìn)行蛋白電泳,經(jīng)轉(zhuǎn)印,牛奶封閉,孵育一抗,二抗,顯色曝光、顯影、定影,最終結(jié)果灰度分析定量分析表達(dá)差異。4采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件處理,Western blot半定量結(jié)果分析采用配對(duì)t檢驗(yàn),P0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果:1本實(shí)驗(yàn)最終鑒定了243個(gè)以平均差異倍數(shù)≥1.2倍及肽段≥2個(gè)為判定標(biāo)準(zhǔn)的差異表達(dá)蛋白,包括ESCC中高表達(dá)蛋白119個(gè)和低表達(dá)蛋白125個(gè);2 243個(gè)差異蛋白的GO富集分析結(jié)果表明:經(jīng)“超幾何檢驗(yàn)”分析,“FDR”多重檢驗(yàn)校正,顯著水平P0.0001的GO條目有123個(gè);與腫瘤十大特征(包括獨(dú)立信號(hào)系統(tǒng);抑制生長信號(hào)降低;減少細(xì)胞死亡;無限分裂特性;促進(jìn)血管發(fā)育;組織浸潤轉(zhuǎn)移;逃脫免疫監(jiān)視;促進(jìn)炎癥形成;異常能量代謝;遺傳物質(zhì)突變不穩(wěn)定)顯著相關(guān)的有17個(gè)GO條目,從而確定該條目包括的117個(gè)蛋白為種子蛋白;通過117個(gè)種子蛋白搜索STRING數(shù)據(jù)庫構(gòu)建蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò),該117個(gè)節(jié)點(diǎn)蛋白共包括255條相互作用;3網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)分析該網(wǎng)絡(luò)各個(gè)節(jié)點(diǎn)的拓?fù)鋵W(xué)評(píng)分,得到36個(gè)關(guān)鍵瓶頸蛋白和39個(gè)關(guān)鍵中心節(jié)點(diǎn)蛋白;上述關(guān)鍵蛋白整合經(jīng)KEGG通路分析表明該蛋白在11條通路顯示重要作用,分別為:黏著斑、蛋白酶體、細(xì)胞外基質(zhì)受體相互作用、肥厚型心肌病、擴(kuò)張型心肌病、致病性大腸桿菌感染、阿米巴病、白細(xì)胞跨內(nèi)皮遷移、心肌收縮、致心律失常性右室心肌病、補(bǔ)體和凝血級(jí)聯(lián)反應(yīng);與公認(rèn)癌基因比對(duì)得到直接相互作用且拓?fù)鋵W(xué)評(píng)分較高的蛋白作為候選蛋白,包括:Fibronectin、Transgelin、Integrinβ1、14-3-3ζ;4 Western blot結(jié)果:ESCC中Fibronectin和Integrinβ1表達(dá)顯著升高,而Transgelin的表達(dá)卻明顯降低;14-3-3ζ在ESCC中的表達(dá)具有降低趨勢(shì),但統(tǒng)計(jì)學(xué)分析無顯著性。結(jié)論:1本實(shí)驗(yàn)確定的ESCC候選標(biāo)志物Fibronectin、Transgelin和Integrinβ1與ESCC顯著相關(guān),其臨床意義及參與ESCC發(fā)生發(fā)展的機(jī)制需進(jìn)一步的研究闡明。
【關(guān)鍵詞】：食管鱗癌 生物信息學(xué) 蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò) 腫瘤蛋白 Fibronectin Transgelin Integrinβ1 14-3-3ζ
【學(xué)位授予單位】：河南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R735.1
【目錄】：

• 摘要4-7
• ABSTRACT7-12
• 縮略詞表12-13
• 1 引言13-15
• 2 實(shí)驗(yàn)儀器與試劑15-19
• 2.1 試劑配方及配置15-18
• 2.2 主要儀器試劑18-19
• 3 實(shí)驗(yàn)方法19-26
• 3.1 ESCC標(biāo)本19
• 3.2 ESCC及癌旁組織蛋白的提取19
• 3.3 BRADFORD法濃度測(cè)定19-20
• 1) 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備19-20
• 2) 待測(cè)樣品處理及檢測(cè)20
• 3) 蛋白濃度計(jì)算20
• 3.4 ITRAQ標(biāo)記消化肽段并檢測(cè)20-21
• 3.5 生物信息學(xué)篩選21-23
• 1) Gene Ontology分析21-22
• 2) Network Analysis22-23
• 3.6 蛋白電泳23-25
• 3.7 細(xì)胞遷移25-26
• 4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果26-37
• 4.1 確定食管鱗癌差異蛋白表達(dá)譜26
• 4.2 GO分析結(jié)果26-30
• 4.3 相互作用網(wǎng)絡(luò)30-31
• 4.4 網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)結(jié)構(gòu)分析結(jié)果31-33
• 4.5 通路分析結(jié)果33-34
• 4.6 癌基因比對(duì)結(jié)果34
• 4.7 篩選關(guān)鍵蛋白驗(yàn)證結(jié)果34-35
• 4.8 TRANSGELIN蛋白的功能驗(yàn)證35-37
• 5 討論37-43
• 6 結(jié)論43-45
• 參考文獻(xiàn)45-49
• 綜述49-61
• 參考文獻(xiàn)56-61
• 致謝61-62

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