本文關(guān)鍵詞：PNA-TPP靶向抑制線粒體融合增強人肺腺癌干細胞荷瘤鼠順鉑化療敏感性的研究

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【摘要】：近幾十年來,肺癌的發(fā)病率及死亡率逐年增加,已成為嚴重威脅人們健康的重要疾病之一。肺癌可分為鱗癌、腺癌、腺鱗癌、小細胞癌以及大細胞癌等病理類型,其中,肺腺癌為最常見的病理類型。目前含鉑類聯(lián)合化療是肺癌治療的重要手段,但效果仍非常有限。研究發(fā)現(xiàn),肺癌干細胞是導(dǎo)致肺癌耐藥、復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的重要原因之一。線粒體,是一個形態(tài)結(jié)構(gòu)與分布不斷動態(tài)變化的細胞器,線粒體內(nèi)、外膜融合與分裂的精細調(diào)控,可能在能量代謝、線粒體DNA穩(wěn)定性與完整性、細胞器結(jié)構(gòu)完整的維持性以及侵襲與轉(zhuǎn)移等方面起著重要作用,此外,近年來研究發(fā)現(xiàn),線粒體融合可保護腫瘤細胞以免于凋亡。我們前期研究發(fā)現(xiàn),與普通肺癌細胞相比,肺腺癌干細胞線粒體具有融合程度增加的現(xiàn)象,其在腫瘤細胞抗凋亡機制中有獨特的作用,這可成為腫瘤治療靶點。抑制肺腺癌干細胞線粒體融合,提高肺腺癌干細胞對順鉑化療的敏感性,清除肺腺癌干細胞,對肺癌治療具有重要臨床意義�；诒菊n題前期研究,肺腺癌干細胞線粒體融合增強,并且增強其耐藥性與抗凋亡特性,本研究旨在構(gòu)建肽核酸-三苯磷復(fù)合物,靶向抑制線粒體融合,增強肺腺癌干細胞順鉑化療敏感性,進而通過構(gòu)建裸鼠荷瘤模型,肽核酸-三苯磷復(fù)合物聯(lián)合順鉑治療荷瘤小鼠,以進一步探究肽核酸-三苯磷復(fù)合物臨床應(yīng)用研究。目的:1.觀察肽核酸-三苯磷復(fù)合物(PNA-TPP)干擾肺腺癌干細胞線粒體能量代謝的生物學(xué)特性,及線粒體融合相關(guān)蛋白的表達;2.構(gòu)建荷瘤模型,探討肽核酸-三苯磷復(fù)合物(PNA-TPP)靶向抑制肺腺癌干細胞線粒體融合,聯(lián)合順鉑是否可提高荷瘤小鼠的化療敏感性。方法:采用無血清培養(yǎng)基(serum-free medium,SFM)的方法將A549細胞誘導(dǎo)成具有干性的A549細胞球;固相肽合成法設(shè)計合成肽核酸-三苯磷復(fù)合物(PNA-TPP);激光共聚焦顯微鏡觀察PNA-TPP轉(zhuǎn)染后細胞線粒體的形態(tài)學(xué)變化,檢測其轉(zhuǎn)染A549細胞球及A549細胞后ATP含量的變化,Western Blot方法檢測轉(zhuǎn)染后干擾線粒體DNA(mt DNA)能量代謝相關(guān)蛋白(ATP6與ND6)表達情況,以及線粒體促融合相關(guān)蛋白MFN1、MFN2、OPA1和ATAD3A的表達情況;A549細胞與具有干性的A549細胞球分別在NOD-SCID小鼠皮下造模,PNA-TPP聯(lián)合順鉑治療荷瘤小鼠,觀察腫瘤體積變化以及治療效果,檢測組織中ATP、活性氧(ROS)、胞漿細胞色素c以及腫瘤組織細胞凋亡情況,免疫組化技術(shù)(Immuno histochemistry,IHC)檢測腫瘤組織促融合蛋白表達情況。結(jié)果:1、設(shè)計合成PNA-TPP復(fù)合物高壓液相色譜分析示,14.44 min處可見一單峰,未見明顯雜質(zhì)峰;質(zhì)譜分析示:復(fù)合物分子量為4398.7,符合設(shè)計要求。2、A549細胞在無血清培養(yǎng)基(SFM)誘導(dǎo)成A549細胞球;PNA-TPP轉(zhuǎn)染于A549細胞及A549細胞球后,細胞ATP含量的明顯下降(P0.05),激光共聚焦觀察線粒體分裂程度增加,PNA-TPP分布與線粒體一致,Western Blot法檢測線粒體重鏈與輕鏈編碼蛋白ATP6與ND6表達明顯抑制(P0.05),Western Blot法檢測線粒體促融合相關(guān)蛋白MFN1、MFN2、OPA1和ATAD3A蛋白的表達均下降(P0.05);3、A549細胞與A549細胞球構(gòu)建荷瘤裸鼠模型,與生理鹽水組與順鉑治療組相比,PNA-TPP聯(lián)合順鉑治療荷瘤裸鼠后,腫瘤體積在第四周與第五周統(tǒng)計具有明顯趨勢(P0.05),組織ATP含量降低(P0.05),PNA-TPP在腫瘤組織中分布與線粒體一致;免疫組織化學(xué)檢測腫瘤組織中線粒體能量代謝相關(guān)蛋白ATP6與ND6、線粒體促融合蛋白MFN1、MFN2、OPA1和ATAD3A表達減少(P0.05);ROS水平增高(P0.05),組織細胞胞漿色素c增加(P0.05),TUNEL檢測細胞凋亡數(shù)明顯增加。結(jié)論:1.A549肺腺癌干細胞線粒體促融合蛋白表達較A549細胞增高,PNA-TPP抑制線粒體能量代謝,抑制線粒體融合蛋白表達。2.PNA-TPP抑制裸鼠腫瘤組織線粒體融合蛋白表達,聯(lián)合可提高其對順鉑化療的敏感性,促進細胞凋亡。
【關(guān)鍵詞】：PNA-TPP 肺腺癌干細胞 線粒體融合
【學(xué)位授予單位】：南昌大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R734.2
【目錄】：

• 摘要3-5
• ABSTRACT5-10
• 中英文縮略詞表10-11
• 第1章 引言11-13
• 第2章 材料與方法13-27
• 2.1 實驗材料13-18
• 2.1.1 細胞株與實驗動物13
• 2.1.2 主要試劑及來源13-14
• 2.1.3 主要儀器和設(shè)備14-15
• 2.1.4 主要試劑配制15-18
• 2.2 實驗方法18-26
• 2.2.1 PNA-TPP干擾肺腺癌干細胞線粒體融合的研究18-22
• 2.2.2 NOD-SCID荷鼠瘤模型構(gòu)建及PNA-TPP聯(lián)合順鉑治療荷瘤鼠干擾線粒體融合的研究22-26
• 2.3 統(tǒng)計方法26-27
• 第3章 結(jié)果27-45
• 3.1 PNA-TPP復(fù)合物的鑒定27
• 3.2 A549細胞與A549細胞球形態(tài)學(xué)，，LCM觀察PNA-TPP復(fù)合物在A549細胞球及A549細胞內(nèi)的空間分布及線粒體形態(tài)學(xué)變化27-29
• 3.2.1 A549細胞及A549細胞球形態(tài)學(xué)27-28
• 3.2.2 LCM觀察線粒體形態(tài)學(xué)28-29
• 3.3 PNA-TPP轉(zhuǎn)染A549細胞球和A549細胞后ATP濃度檢測29-30
• 3.4 Western Blot檢測PNA-TPP復(fù)合物轉(zhuǎn)染A549細胞和A549細胞球后線粒體重鏈與輕鏈蛋白ATP6與ND6表達30-31
• 3.5 Western Blot檢測PNA-TPP復(fù)合物轉(zhuǎn)染A549細胞和A549細胞球抑制線粒體促融合相關(guān)蛋白MFN1、MFN2、OPA1和ATAD3A的表達31-32
• 3.6 裸鼠成瘤實驗32-33
• 3.7 PNA-TPP在腫瘤組織中分布情況33-34
• 3.8 腫瘤組織ATP濃度檢測34-35
• 3.9 各組腫瘤組織線粒體重鏈編碼蛋白ATP6與輕鏈編碼蛋白ND6免疫組化結(jié)果35-37
• 3.10 各組腫瘤組織線粒體融合相關(guān)蛋白MFN1、MFN2、OPA1及ATAD3A免疫組化結(jié)果37-42
• 3.11 腫瘤組織胞漿細胞色素c濃度檢測42-43
• 3.12 腫瘤組織ROS水平檢測43-44
• 3.13 各組腫瘤組織細胞凋亡TUNEL實驗結(jié)果44-45
• 第4章 討論45-50
• 第5章 結(jié)論與展望50-51
• 5.1 結(jié)論50
• 5.2 展望50-51
• 致謝51-52
• 參考文獻52-56
• 攻讀學(xué)位期間的研究成果56-57
• 綜述57-64
• 參考文獻62-64

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本文編號：605557