本文關(guān)鍵詞：Tspan5在胃癌中的表達(dá)及調(diào)節(jié)胃癌細(xì)胞增殖機(jī)制的研究

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【摘要】：背景：胃癌(Gastric Carcinoma, GC)是位于第四位人類最常見腫瘤,也是腫瘤相關(guān)性死亡最常見的原因之一。在2008年,全球總共有989,600新增胃癌病例和738,000例胃癌估計死亡率,占全球癌癥病例總數(shù)的8%和估計癌癥死亡總?cè)藬?shù)的10%。而胃癌發(fā)病率最高的地區(qū)是在亞洲東部,東歐和南美。近年來,隨著診斷技術(shù)的進(jìn)步及針對腫瘤的外科手術(shù)和放化療治療策略的成熟,但由于胃癌的復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移,患者的預(yù)后仍然并不令人十分滿意。此外,盡管TNM(tumor-node-metastasis)臨床分期是使用最廣泛的分期系統(tǒng),并對胃癌患者的預(yù)后有提示意義,但它依舊是很難獲得患者其它相對具體的臨床預(yù)后信息。因此,發(fā)展對患者預(yù)后進(jìn)行評估預(yù)測的新的生物標(biāo)志物,對于目前來說是非常迫切需要的。而且胃癌相關(guān)基因及其蛋白分子不僅在了解胃癌的發(fā)病機(jī)制方面十分重要,在臨床靶向性治療和改善預(yù)后等方面也意義重大。Tspan5(tetraspanin 5, net4, TMS4SF9),屬于四分子交聯(lián)體超家族(tetraspanin)中的一員。Tetraspanin是四次跨膜的小分子細(xì)胞膜蛋白(20-50kDa),其特點是有四個比較保守的跨膜域(TM). TM延伸到細(xì)胞膜外,形成一個小的胞外環(huán)和一個大的胞外環(huán),而在胞內(nèi)則形成一個很短的氨基末端和一個羧基末端。Tetraspanin可以與其他同是Tetraspanin成員的細(xì)胞跨膜受體蛋白通過相互作用形成復(fù)合物,此復(fù)合物被稱為富含tetraspanin的胞膜微結(jié)構(gòu)域。在人類tetraspanin家族中已有33的成員被發(fā)現(xiàn),但只有少數(shù)關(guān)于該家族成員在哺乳動物細(xì)胞上進(jìn)行研究。有幾項研究分別揭示在tetraspanin家族中,例如TSPAN1(NET-1)、 TSPAN13(NET-6)、TSPAN24(CD151)、TSPAN27(CD82)、TSPAN28和TSPAN29(CD9),表明他們在某些人類癌癥中下調(diào)或表達(dá)升高,這意味著這些tetraspanin成員可能參與腫瘤發(fā)生或腫瘤的進(jìn)展惡化。而相比之下,關(guān)于Tspan5在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移作用方面則所知甚少。我們都知道惡性腫瘤的特點是無限增殖,其無限增殖多與細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡障礙密切相關(guān)。細(xì)胞周期進(jìn)程的失調(diào)被認(rèn)為在腫瘤發(fā)生中發(fā)揮著重要作用。大量的研究表明,細(xì)胞周期失調(diào)在腫瘤復(fù)發(fā)及進(jìn)展方面負(fù)有很大的責(zé)任。在本文中,我們旨在研究Tspan5在胃癌發(fā)生發(fā)展中所起的作用及其臨床意義。此外,我們對Tspan5和胃癌細(xì)胞周期蛋白變化之間的關(guān)系非常感興趣,希望可以揭示腫瘤發(fā)生發(fā)展的機(jī)制,發(fā)展新的治療方法和預(yù)測疾病預(yù)后的生物標(biāo)志物。目的：1明確Tspan5在臨床胃癌組織標(biāo)本中的表達(dá)情況,與胃癌患者病情發(fā)展、預(yù)后的關(guān)系。2探討Tspan5在影響胃癌細(xì)胞增殖、生長方面的生物學(xué)作用。3在體內(nèi)外探討Tspan5對胃癌細(xì)胞周期的影響及其相關(guān)機(jī)制。4探討Tspan5在影響胃癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移方面的生物學(xué)作用。方法：1采用組織免疫化學(xué)染色的方法在114例臨床胃癌組織標(biāo)本中,分析Tspan5的表達(dá)量與臨床胃癌發(fā)展、預(yù)后的關(guān)系。2基于基因克隆技術(shù),將Tspan5片段克隆到逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)質(zhì)粒plncx2-GFP-IRES中,經(jīng)酶切、測序鑒定正確無誤后,與pVSV-G共轉(zhuǎn)染至GP2-293細(xì)胞中進(jìn)行病毒包裝。將包裝的高表達(dá)逆轉(zhuǎn)錄病毒感染胃癌AGS和MKN45細(xì)胞,而后經(jīng)G418初步篩選形成穩(wěn)定株,然后經(jīng)Western blot鑒定后,擴(kuò)大培養(yǎng)、凍存穩(wěn)定細(xì)胞株。3 CCK-8法檢測穩(wěn)定高表達(dá)Tspan5的重組細(xì)胞的增殖生長情況,同時用平板克隆形成實驗檢測重組細(xì)胞在體外克隆形成的能力,然后將重組胃癌細(xì)胞在裸鼠皮下接種成瘤,觀察其在裸鼠體內(nèi)的成瘤能力。4通過流式細(xì)胞術(shù)分析Tspan5對胃癌AGS和MKN45細(xì)胞周期的影響。同時,通過蛋白電泳及瘤體組織片免疫組化對重組胃癌細(xì)胞周期蛋白分子Cyclin D1、CDK4、p15、p27、E2F1和pRB的變化進(jìn)行驗證。5細(xì)胞趨化運動和侵襲轉(zhuǎn)移實驗,劃痕實驗分析Tspan5在重組胃癌AGS和MKN45細(xì)胞在體外的轉(zhuǎn)移能力所起的作用。結(jié)果：1在114例臨床標(biāo)本中,通過免疫組化染色顯示,Tspan5低表達(dá)于胃癌組織而高表達(dá)于相應(yīng)癌旁組織。在癌組織中,Tspan5的表達(dá)量的高低與腫瘤大小、腫瘤侵襲程度、腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和臨床TNM分期密切相關(guān)。隨著TNM分期程度的升高,Tspan5表達(dá)量逐漸降低。在生存期分析中,低表達(dá)Tspan5癌組織的患者,與高表達(dá)Tspan5癌組織的患者相比,其中位生存時間和生存率均顯著下降。2逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體plncx2-GFP-IRES/Tspan5經(jīng)酶切和測序鑒定構(gòu)建成功,并與pVSV-G在GP2-293細(xì)胞中包裝得到了高表達(dá)Tspan5的逆轉(zhuǎn)錄病毒。該病毒感染的胃癌AGS和MKN45細(xì)胞經(jīng)高濃度G418篩選得到了穩(wěn)定的重組細(xì)胞株。重組細(xì)胞株經(jīng)Western blot實驗證實構(gòu)建成功。3 CCK-8實驗中高表達(dá)Tspan5的胃癌AGS和MKN45重組細(xì)胞株,體外生長速度明顯慢于對照細(xì)胞(AGS-RV和MKN45-RV);平板克隆實驗顯示高表達(dá)Tspan5的胃癌AGS和MKN45重組細(xì)胞株的體外克隆生長能力明顯弱于對照細(xì)胞,克隆形成的大小也小于對照組細(xì)胞,差異具有統(tǒng)計意義。裸鼠皮下成瘤實驗也顯示了高表達(dá)Tspan5的胃癌AGS和MKN45重組細(xì)胞株的皮下成瘤速度及大小均明顯弱于對照組細(xì)胞(AGS-RV和MKN45-RV),差異具有統(tǒng)計意義。4我們也進(jìn)一步證明Tspan5在從細(xì)胞周期G1期到S期的過渡階段進(jìn)行調(diào)控,是通過增加p15／p27蛋白的表達(dá),同時減少細(xì)胞周期蛋白Cyclin D1/CDK4/ E2F1/p-RB的表達(dá)而實現(xiàn)的。5我們在高表達(dá)Tspan5的重組胃癌細(xì)胞株中,通過轉(zhuǎn)染pCMV-Myc-CDK4,重新高表達(dá)其CDK4蛋白量,并通過蛋白電泳證實上調(diào)成功。48小時后,我們使用CCK-8分析評估該重新高表達(dá)CDK4的細(xì)胞的增殖能力情況。我們發(fā)現(xiàn)在胃癌AGS或MNK45細(xì)胞中,轉(zhuǎn)染了質(zhì)粒pCMV-Myc-CDK4的高表達(dá)Tspan5的細(xì)胞與轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒pCMV-Myc的高表達(dá)Tspan5的細(xì)胞相比,其增殖能力顯著升高,并較對照組(control組)的增殖能力升高。同樣,轉(zhuǎn)染表達(dá)質(zhì)粒pENTER-Cyclin D1后,其增殖能力也顯著增加,并較對照組(control組)增殖能力也升高。這表明Tspan5抑制胃癌細(xì)胞的增殖是通過控制細(xì)胞周期從G1期到S期的過渡階段,通過下調(diào)Cyclin D1和CDK4蛋白表達(dá)量而實現(xiàn)的。6細(xì)胞趨化運動和侵襲轉(zhuǎn)移運動(transwell)實驗表明,Tspan5顯著抑制了胃癌AGS和MKN45細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力。與transwell的實驗結(jié)果一致,劃痕實驗也得到了類似的結(jié)果。因此,以上結(jié)果表明,Tspan5可能可作為抑制胃癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移的抑癌基因。結(jié)論：在臨床胃癌組織中,Tspan5氏表達(dá)于癌組織而高表達(dá)于相應(yīng)癌旁組織,Tspan5的表達(dá)量的高低與腫瘤大小、腫瘤侵襲程度、腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和臨床TNM分期密切相關(guān)。隨著TNM分期程度的升高,Tspan5表達(dá)量逐漸降低。在生存期分析中,低表達(dá)Tspan5癌組織的患者,與高表達(dá)Tspan5癌組織的患者相比,其中位生存時間和生存率均顯著下降。以上提示Tspan5可能是一個新的胃癌抑制分子。通過基因克隆技術(shù)、逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝技術(shù)和蛋白電泳驗證,我們成功構(gòu)建了穩(wěn)定高表達(dá)Tspan5的胃癌AGS和MKN45重組細(xì)胞株。通過CCK-8實驗和平板克隆形成實驗證實高表達(dá)Tspan5抑制胃癌AGS和MKN45重組細(xì)胞的體外增殖和生長。裸鼠皮下成瘤實驗顯示高表達(dá)Tspan5抑制胃癌AGS細(xì)胞的成瘤能力。高表達(dá)Tspan5可以抑制胃癌AGS和MKN45重組細(xì)胞由G1期到S期的進(jìn)程,其分子機(jī)制是下調(diào)Cyclin D1、CDK4、pRB和E2F1蛋白分子的表達(dá)和上調(diào)抑癌因子p27和p15的表達(dá)。同時在裸鼠的移植瘤的免疫組化中,Cyclin D1, CDK4, E2F1, pRb, p27和p15這四種分子的變化與在上訴的變化一致。我們又通過在高表達(dá)Tspan5的重組胃癌細(xì)胞基礎(chǔ)上上調(diào)Cyclin D1或CDK4的表達(dá)量后,其周期進(jìn)程抑制現(xiàn)象得到緩解。上訴實驗結(jié)果均表明Tspan5在胃癌中的作用是抑癌基因,可作為發(fā)展新的治療胃癌方法和預(yù)測胃癌患者預(yù)后的生物標(biāo)志物。
【關(guān)鍵詞】：胃癌 Tspan5 細(xì)胞周期 抑癌基因 生物標(biāo)記物
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R735.2
【目錄】：

• 摘要3-8
• ABSTRACT8-15
• 前言15-20
• 參考文獻(xiàn)17-20
• 第一章 TSPAN5在胃正常組織和癌組織中的表達(dá)及臨床意義20-29
• 1.1 引言20
• 1.2 材料與方法20-23
• 1.3 結(jié)果23-27
• 1.4 小結(jié)27-29
• 第二章 構(gòu)建高表達(dá)TSPAN5的重組胃癌細(xì)胞株及探討TSPAN5對胃癌細(xì)胞生長的影響29-48
• 2.1 引言29
• 2.2 實驗材料29-33
• 2.3 實驗方法33-38
• 2.4 結(jié)果38-46
• 2.5 小結(jié)46-48
• 第三章 高表達(dá)TSPAN5調(diào)節(jié)胃癌細(xì)胞周期的機(jī)制研究48-63
• 3.1 引言48
• 3.2 材料與試劑48-51
• 3.3 方法51-54
• 3.4 結(jié)果54-62
• 3.5 小結(jié)62-63
• 第四章 高表達(dá)TSPAN5對胃癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的影響63-66
• 4.1 引言63
• 4.2 材料與試劑63
• 4.3 方法63-64
• 4.4 結(jié)果64-65
• 4.5 小結(jié)65-66
• 第五章 討論66-71
• 參考文獻(xiàn)71-74
• 英漢縮略名詞對照74-76
• 成果76-77
• 致謝77-78

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本文編號：590838