本文關(guān)鍵詞：活體成像系統(tǒng)在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤血管生長(zhǎng)中的評(píng)估作用

  更多相關(guān)文章： 綠色熒光蛋白 膠質(zhì)母細(xì)胞瘤 慢病毒 皮下成瘤 活體熒光成像 膠質(zhì)母細(xì)胞瘤血管形成

【摘要】：第一部分穩(wěn)定表達(dá)綠色熒光蛋白膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株建立及生物學(xué)特性評(píng)價(jià)目的:體外分離培養(yǎng)人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤,穩(wěn)定傳代培養(yǎng)后,通過(guò)慢病毒轉(zhuǎn)染構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)綠色熒光蛋白的細(xì)胞株GBM-EGFP,并對(duì)其生物學(xué)特性進(jìn)行評(píng)價(jià)。方法:通過(guò)慢病毒載體將攜帶增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(enhanced green flurescent protein EGFP)慢病毒轉(zhuǎn)染原代GBM細(xì)胞株,并進(jìn)行篩選和擴(kuò)大培養(yǎng),構(gòu)建出穩(wěn)定表達(dá)EGFP的單細(xì)胞克隆株:GBM-EGFP。體外經(jīng)10次傳代后流式細(xì)胞分析檢測(cè)細(xì)胞株熒光表達(dá)的穩(wěn)定性;對(duì)GBM及GBM-EGFP兩種細(xì)胞株在生長(zhǎng)周期,細(xì)胞生長(zhǎng)曲線,侵襲性,VEGF的表達(dá)及裸鼠皮下成瘤方面進(jìn)行觀察,觀察經(jīng)慢病毒轉(zhuǎn)染后構(gòu)建的細(xì)胞株GBM-EGFP較原代細(xì)胞的生物學(xué)特性是否發(fā)生改變。結(jié)果:通過(guò)慢病毒介導(dǎo)轉(zhuǎn)染膠質(zhì)母細(xì)胞瘤,通過(guò)篩選及單克隆建立GBM-EGFP細(xì)胞株,能夠在體外穩(wěn)定持續(xù)表達(dá)綠色熒光蛋白。經(jīng)過(guò)30天體外培養(yǎng)后,能高效穩(wěn)定表達(dá)綠色熒光,流式分析檢測(cè)表達(dá)率為84%;細(xì)胞形態(tài)較原代細(xì)胞未發(fā)生改變。GBM-EGFP細(xì)胞株生長(zhǎng)曲線、細(xì)胞周期、侵襲能力與未轉(zhuǎn)染的原代GBM一致。將GBM-EGFP細(xì)胞注入BALB/c-nu小鼠皮下,分別建立GBM及GBM-EGFP裸鼠皮下模型,顯示兩者在成瘤率、腫瘤生長(zhǎng)趨勢(shì)方面及腫瘤組織形態(tài)學(xué)上無(wú)差異。結(jié)論:通過(guò)慢病毒載體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染方法建立起來(lái)的GBM-EGFP細(xì)胞株能穩(wěn)定高效表達(dá)綠色熒光蛋白,細(xì)胞生物學(xué)特性與母系GBM基本一致,為研究膠質(zhì)瘤的復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移提供了一個(gè)良好的工具。第二部分活體成像系統(tǒng)在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤血管生長(zhǎng)中的評(píng)估作用目的:通過(guò)活體成像系統(tǒng)建立穩(wěn)定表達(dá)綠色熒光蛋白的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤皮下腫瘤模型,動(dòng)態(tài)觀察腫瘤生長(zhǎng)及血管生成,分析兩者之間的關(guān)系,從而為研究膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā),評(píng)估靶向治療提供有效的動(dòng)物模型。方法:建立小鼠皮下腫瘤模型:取25只裸鼠隨機(jī)分成5組,于4周齡大小時(shí)皮下注射1x106個(gè)GBM-EGFP細(xì)胞。另取9只作為對(duì)照組,注射1x106個(gè)GBM細(xì)胞,分別于1w,1.5w,2w,2.5w,3w,3.5w,4w,4.5w,5w時(shí)以活體成像系統(tǒng)觀察小鼠腫瘤熒光表達(dá)情況,測(cè)定熒光值(以光子數(shù)表示)。并于活體成像后取實(shí)驗(yàn)組及參照組裸鼠各一只取腫瘤組織行HE染色及人CD34免疫組化(IH)觀察腫瘤血管發(fā)生及形態(tài),統(tǒng)計(jì)微血管密度(MVD),同時(shí)行CD34免疫熒光(IF)觀察腫瘤來(lái)源內(nèi)皮細(xì)胞。體外取不同細(xì)胞濃度的細(xì)胞送活體成像系統(tǒng),分析不同濃度細(xì)胞與熒光值之間的關(guān)系,用以計(jì)算腫瘤不同時(shí)間段腫瘤內(nèi)細(xì)胞數(shù),從而分析腫瘤生長(zhǎng)與血管發(fā)生及血管形態(tài)之間的關(guān)系,最后以流式加以驗(yàn)證。結(jié)果:體外實(shí)驗(yàn)顯示GBM-EGFP熒光表達(dá)穩(wěn)定,且熒光強(qiáng)度與細(xì)胞數(shù)呈直線正相關(guān)。小鼠活體成像系統(tǒng)顯示接種后1w后腫瘤可在活體成像系統(tǒng)中觀察到熒光,熒光表達(dá)隨腫瘤生長(zhǎng)逐漸增強(qiáng)。HE染色及免疫組化顯示腫瘤接種后3d開始出現(xiàn)幼稚血管,1w開始腫瘤中央開始?jí)乃?壞死周圍出現(xiàn)血管出芽結(jié)構(gòu),MVD在3-4w時(shí)增值最快,4w達(dá)到峰值,此后進(jìn)入平臺(tái)期,流式結(jié)果分析顯示4w時(shí)CD34+陽(yáng)性率為1.63%。結(jié)論:通過(guò)活體成像系統(tǒng)可建立穩(wěn)定表達(dá)綠色熒光的膠質(zhì)瘤皮下腫瘤模型,實(shí)現(xiàn)了對(duì)膠質(zhì)瘤體外生長(zhǎng)的長(zhǎng)期動(dòng)態(tài)觀察,為研究膠質(zhì)瘤的體外生長(zhǎng)提供了良好模型;同時(shí)通過(guò)免疫熒光觀察到腫瘤來(lái)源的內(nèi)皮細(xì)胞,統(tǒng)計(jì)了MVD,并以流式加以驗(yàn)證,為腫瘤來(lái)源內(nèi)皮細(xì)胞分選創(chuàng)造了條件。
【關(guān)鍵詞】：綠色熒光蛋白 膠質(zhì)母細(xì)胞瘤 慢病毒 皮下成瘤 活體熒光成像 膠質(zhì)母細(xì)胞瘤血管形成
【學(xué)位授予單位】：暨南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R739.41
【目錄】：

• 中文摘要3-5
• Abstract5-9
• 第一部分：穩(wěn)定表達(dá)綠色熒光蛋白膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株建立及生物學(xué)特性評(píng)價(jià)9-28
• 前言9-10
• 材料及方法10-19
• 結(jié)果19-24
• 討論24-26
• 結(jié)論26
• 參考文獻(xiàn)26-28
• 第二部分：活體成像系統(tǒng)在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤血管生長(zhǎng)中的評(píng)估作用28-51
• 前言28-29
• 試劑及材料29-30
• 實(shí)驗(yàn)方法30-35
• 結(jié)果35-47
• 討論47-50
• 結(jié)論50-51
• 本研究的不足及展望51-52
• 參考文獻(xiàn)52-54
• 縮略詞表54-55
• 在校期間發(fā)表的論文列表及參與科研項(xiàng)目55-56
• 致謝56

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本文編號(hào)：589899