本文關(guān)鍵詞：microRNA98靶向N-RAS調(diào)控涎腺腺樣囊性癌惡性生物學(xué)行為的研究

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【摘要】：目的探討miR-98在涎腺腺樣囊性癌組織和癌旁組織、高/低轉(zhuǎn)移細(xì)胞系中的表達(dá)差異及其對(duì)腺樣囊性癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲的影響,通過生物信息學(xué)軟件尋找mi R-98的潛在靶基因并初步探討miR-98參與調(diào)控涎腺腺樣囊性癌的作用機(jī)理。方法1、miR-98在涎腺腺樣囊性癌中的表達(dá)及其對(duì)涎腺腺樣囊性癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的影響:通過real-time PCR檢測(cè)3例新鮮涎腺腺樣囊性癌組織以及癌旁正常組織、高轉(zhuǎn)移細(xì)胞系A(chǔ)CC-M以及低轉(zhuǎn)移細(xì)胞系SACC-83中miR-98的表達(dá)水平。采用lipofectamine2000介導(dǎo)轉(zhuǎn)染mi R-98mimics使miR-98過表達(dá),并通過RT-PCR驗(yàn)證。通過MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖能力的變化,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期的變化,劃痕實(shí)驗(yàn)、趨化運(yùn)動(dòng)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)遷移能力變化,Transwell檢測(cè)侵襲能力變化,Western blotting檢測(cè)遷移相關(guān)蛋白的表達(dá)變化。2、miR-98靶向N-RAS通過RAS信號(hào)通路調(diào)控涎腺腺樣囊性癌的作用機(jī)理:采用生物信息學(xué)軟件TargetScan、PicTar、miRbase等對(duì)miR-98潛在的靶基因結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)N-RAS基因mRNA的3,非翻譯區(qū)中多個(gè)軟件預(yù)測(cè)的共同結(jié)合位點(diǎn)區(qū)域。構(gòu)建包含結(jié)合位點(diǎn)的野生型熒光素酶報(bào)告基因載體WT-NRAS-PGL3-control及突變型的熒光素酶報(bào)告基因載體MUT-NRAS-PGL3-control。雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證N-RAS是mi R-98的靶基因。miR-98mimics轉(zhuǎn)染細(xì)胞調(diào)高mi R-98的表達(dá)水平后,Western blotting以及免疫熒光技術(shù)檢測(cè)N-RAS的表達(dá)變化,Western blotting檢測(cè)N-RAS蛋白的表達(dá)變化以及下游MAPK/ERK信號(hào)通路中ERK、p-ERK和PI3K/AKT信號(hào)通路中AKT、p-AKT的表達(dá)變化。收集我院涎腺腺樣囊性癌石蠟標(biāo)本43例及臨床病理資料,免疫組織化學(xué)檢測(cè)涎腺腺樣囊性癌石蠟標(biāo)本中N-RAS的表達(dá)情況,并與臨床病理因素行相關(guān)性分析。結(jié)果1、miR-98在涎腺腺樣囊性癌組織和高轉(zhuǎn)移細(xì)胞系中的表達(dá)水平顯著低于癌旁正常組織和低轉(zhuǎn)移細(xì)胞系SACC-83,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。以ACC-M作為細(xì)胞模型,轉(zhuǎn)染miR-98 mimics調(diào)高miR-98的表達(dá)水平;MTT結(jié)果顯示miR-98過表達(dá)后,細(xì)胞的增殖能力受到抑制;平板克隆實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示細(xì)胞的克隆形成率下降;流式細(xì)胞術(shù)提示S期的細(xì)胞明顯減少,而G0/G1期的細(xì)胞明顯增多,表明細(xì)胞被阻滯在G0/G1期向S期的轉(zhuǎn)化進(jìn)程中;劃痕閉合延遲、趨化實(shí)驗(yàn)穿膜細(xì)胞數(shù)減少,細(xì)胞的遷移能力下降;Transwell小室穿過基質(zhì)的細(xì)胞數(shù)減少,細(xì)胞的侵襲能力下降;Western blotting檢測(cè)遷移相關(guān)蛋白,E-cadherin的表達(dá)上調(diào),N-cadherin、Vimentin的表達(dá)下調(diào)。2、生物信息學(xué)軟件TargetScan、PicTar、miRbase分析結(jié)果顯示N-RAS是miR-98的靶基因之一,3個(gè)靶基因數(shù)據(jù)庫(kù)的預(yù)測(cè)結(jié)果顯示的其結(jié)合位點(diǎn)均含有位于N-RAS基因3,端的186-192的堿基序列。miR-98 mimics轉(zhuǎn)染后48h,RT-PCR驗(yàn)證miR-98在轉(zhuǎn)染組中的表達(dá)水平上調(diào);Western blotting結(jié)果顯示miR-98過表達(dá)后N-RAS蛋白的表達(dá)水平下降;免疫熒光結(jié)果顯示N-RAS的表達(dá)定位于細(xì)胞漿,miR-98過表達(dá)后胞漿的熒光信號(hào)減弱。雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)發(fā)現(xiàn)miR-98能夠顯著抑制野生型報(bào)告基因載體WT-NRAS-PGL3-control的熒光素酶活性,而對(duì)突變型報(bào)告基因載體MUT-NRAS-PGL3-control的熒光素酶活性沒有影響。miR-98 mimics轉(zhuǎn)染后48h,提取總蛋白,Western blotting結(jié)果顯示miR-98過表達(dá)后MAPK/ERK信號(hào)通路中ERK蛋白的表達(dá)水平不變,而p-ERK蛋白的表達(dá)水平下調(diào);PI3K/AKT信號(hào)通路中AKT蛋白的表達(dá)水平不變,而p-AKT蛋白的表達(dá)水平下調(diào)。N-RAS在涎腺腺樣囊性癌組織中主要在胞漿中呈陽性表達(dá),其陽性表達(dá)率為83.7%(36/43),N-RAS的表達(dá)水平與臨床分期、腫瘤大小相關(guān)(P0.05),而與性別、年齡、組織分型、頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)。結(jié)論1、miR-98在涎腺腺樣囊性癌中呈低表達(dá)狀態(tài)。miR-98通過阻滯細(xì)胞周期中G0/G1期向S期的轉(zhuǎn)化進(jìn)程,抑制涎腺腺樣囊性癌細(xì)胞的增殖能力,并且抑制ACC-M細(xì)胞的遷移和侵襲能力。2、N-RAS是mi R-98的靶基因,其過表達(dá)與涎腺腺樣囊性癌的臨床分期及腫瘤大小相關(guān)。miR-98通過調(diào)控N-RAS下游的MAPK/ERK和PI3K/AKT信號(hào)通路影響腺樣囊性癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲能力。
【關(guān)鍵詞】：涎腺腺樣囊性癌 miR-98 N-RAS 遷移 侵襲
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R739.87
【目錄】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-10
• 縮略語/符號(hào)說明10-11
• 前言11-15
• 研究現(xiàn)狀、成果11-13
• 研究目的、方法13-15
• 一、miR-98調(diào)控涎腺腺樣囊性癌的惡性生物學(xué)行為15-34
• 1.1 對(duì)象和方法15-26
• 1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料15-18
• 1.1.2 實(shí)驗(yàn)方法18-26
• 1.1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理26
• 1.2 結(jié)果26-31
• 1.2.1 miR-98在涎腺腺樣囊性癌中的表達(dá)26-27
• 1.2.2 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)miR-98 mimics在ACC-M中的轉(zhuǎn)染效果27
• 1.2.3 MTT法檢測(cè)miR-98 mimics轉(zhuǎn)染后細(xì)胞增殖能力的變化27
• 1.2.4 平板克隆法檢測(cè)miR-98 mimics轉(zhuǎn)染后細(xì)胞克隆形成能力的變化27-28
• 1.2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)miR-98 mimics轉(zhuǎn)染后細(xì)胞周期的變化28-29
• 1.2.6 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-98 mimics轉(zhuǎn)染后細(xì)胞遷移能力的變化29
• 1.2.7 趨化實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-98 mimics轉(zhuǎn)染后細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力的變化29-30
• 1.2.8 Transwell檢測(cè)miR-98 mimics轉(zhuǎn)染后細(xì)胞侵襲能力的變化30
• 1.2.9 miR-98 mimics轉(zhuǎn)染后遷移相關(guān)蛋白的表達(dá)變化30-31
• 1.3 討論31-33
• 1.4 小結(jié)33-34
• 二、miR-98靶向N-RAS通過RAS信號(hào)通路調(diào)控涎腺腺樣囊性癌的機(jī)制探討34-51
• 2.1 對(duì)象和方法34-42
• 2.1.1 實(shí)驗(yàn)對(duì)象及材料34-35
• 2.1.2 實(shí)驗(yàn)方法35-42
• 2.1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理42
• 2.2 結(jié)果42-47
• 2.2.1 N-RAS在涎腺腺樣囊性癌細(xì)胞及組織中的表達(dá)42
• 2.2.2 miR-98負(fù)性調(diào)控靶基因N-RAS的表達(dá)42-43
• 2.2.3 成功構(gòu)建熒光素酶基因報(bào)告載體43-45
• 2.2.4 雙熒光素酶報(bào)告驗(yàn)證miR-98與N-RAS的直接調(diào)控關(guān)系45
• 2.2.5 miR-98過表達(dá)后ERK/p-ERK,AKT/p-AKT的表達(dá)變化45-46
• 2.2.6 N-RAS在涎腺腺樣囊性癌石蠟組織中的表達(dá)46-47
• 2.2.7 N-RAS在涎腺腺樣囊性癌中表達(dá)的臨床意義47
• 2.3 討論47-50
• 2.4 小結(jié)50-51
• 結(jié)論51-52
• 參考文獻(xiàn)52-58
• 發(fā)表論文和參加科研情況說明58-59
• 綜述 涎腺腺樣囊性癌侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)因子的研究進(jìn)展59-68
• 綜述參考文獻(xiàn)64-68
• 致謝68-70
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷70

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