本文關(guān)鍵詞：P53在非轉(zhuǎn)錄依賴凋亡途徑中向線粒體遷移機(jī)制的研究

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【摘要】：為了維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定,細(xì)胞內(nèi)基因可以控制細(xì)胞自主有序的死亡,這就是細(xì)胞凋亡。細(xì)胞凋亡是維持體內(nèi)細(xì)胞數(shù)量動(dòng)態(tài)平衡的基本措施,在胚胎發(fā)育階段,細(xì)胞凋亡清除已完成使命的細(xì)胞,在成年階段,細(xì)胞凋亡清除衰老和病變的細(xì)胞,保證機(jī)體的健康發(fā)育。而惡性腫瘤的發(fā)生是因?yàn)榧?xì)胞增殖不受控制,從細(xì)胞凋亡的角度來(lái)看,正是因?yàn)閻盒阅[瘤的凋亡機(jī)制被抑制,導(dǎo)致本應(yīng)啟動(dòng)凋亡程序的細(xì)胞沒(méi)能被清除。細(xì)胞凋亡途徑受多種基因調(diào)控,其中最重要的調(diào)控基因就是p53。p53是重要的抑癌基因,在正常細(xì)胞中,當(dāng)細(xì)胞受損時(shí),p53通過(guò)不同通路調(diào)控細(xì)胞周期或DNA修復(fù)或誘導(dǎo)凋亡。眾多腫瘤細(xì)胞研究表明,超過(guò)50%的腫瘤細(xì)胞中調(diào)控誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的重要抑癌基因p53發(fā)生突變,無(wú)法發(fā)揮自身調(diào)控功能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。因此,研究p53誘導(dǎo)凋亡的機(jī)制將是癌癥基因治療的重要方向。本文中主要探究了p53非轉(zhuǎn)錄依賴凋亡途徑中p53向線粒體遷移的可能機(jī)制。利用非細(xì)胞體系和細(xì)胞瞬轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn),通過(guò)鏡下觀察線粒體破膜和Western Blot檢測(cè)的方式,從細(xì)胞外和細(xì)胞內(nèi)實(shí)驗(yàn)兩部分驗(yàn)證p53向線粒體遷移的影響因素和可能機(jī)制。結(jié)果表明,在細(xì)胞外,p53可以直接誘導(dǎo)線粒體膜通透性的增加及細(xì)胞色素c的釋放;在細(xì)胞內(nèi),胞漿p53蛋白具有自發(fā)向線粒體遷移的特點(diǎn),受到外源刺激時(shí),內(nèi)源p53蛋白可在6小時(shí)內(nèi)累積并向線粒體遷移,而外源p53蛋白在胞漿內(nèi)無(wú)需上游刺激信號(hào)即可在線粒體部位富集,并且p53蛋白的N端結(jié)構(gòu)域及DBD結(jié)構(gòu)域在p53線粒體遷移過(guò)程中可能起到重要的調(diào)控作用。
【關(guān)鍵詞】：P53 線粒體 細(xì)胞凋亡
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：R73-3
【目錄】：

• 提要4-5
• 中文摘要5-7
• Abstract7-12
• 第1章 前言12-20
• 1.1 p53蛋白簡(jiǎn)介12
• 1.2 p53蛋白的結(jié)構(gòu)12-13
• 1.3 p53蛋白的功能13-15
• 1.3.1 p53參與細(xì)胞周期調(diào)控14
• 1.3.2 p53參與DNA損傷修復(fù)14-15
• 1.3.3 p53與細(xì)胞衰老15
• 1.4 p53蛋白與細(xì)胞凋亡15-17
• 1.4.1 p53轉(zhuǎn)錄依賴凋亡途徑16
• 1.4.2 p53非轉(zhuǎn)錄依賴凋亡途徑16-17
• 1.5 研究意義、擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題及技術(shù)路線17-20
• 第2章 p53及其分段的質(zhì)粒構(gòu)建20-32
• 2.1 材料與設(shè)備20-24
• 2.1.1 表達(dá)載體20-22
• 2.1.2 主要試劑22-23
• 2.1.3 主要儀器與設(shè)備23-24
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法24-28
• 2.2.1 引物設(shè)計(jì)24
• 2.2.2 p53及其分段質(zhì)粒的構(gòu)建24-27
• 2.2.3 相關(guān)溶液的配制27-28
• 2.3 結(jié)果與分析28-32
• 2.3.1 p53部分截短質(zhì)粒目的片段的退火溫度優(yōu)化28-29
• 2.3.2 將目的片段構(gòu)建到pc3.1 載體中29-32
• 第3章 p53蛋白對(duì)線粒體的細(xì)胞外作用分析32-45
• 3.1 材料與設(shè)備32-34
• 3.1.1 主要試劑32-33
• 3.1.2 主要儀器與設(shè)備33-34
• 3.2 實(shí)驗(yàn)方法34-40
• 3.2.1 轉(zhuǎn)化宿主菌34-35
• 3.2.2 目的蛋白誘導(dǎo)表達(dá)條件的優(yōu)化35-36
• 3.2.3 蛋白的大量表達(dá)36
• 3.2.4 Ni柱蛋白純化36-37
• 3.2.5 Ni柱的重生37
• 3.2.6 考馬斯亮蘭染色37
• 3.2.7 細(xì)胞株37-38
• 3.2.8 細(xì)胞培養(yǎng)液配制38
• 3.2.9 胰酶配制38
• 3.2.10 磷酸鹽緩沖液（PBS）38
• 3.2.11 細(xì)胞凍存及復(fù)蘇38
• 3.2.12 蛋白濃度測(cè)定38-39
• 3.2.13 非細(xì)胞體系39-40
• 3.3 結(jié)果與分析40-45
• 3.3.1 p53蛋白的原核表達(dá)40-41
• 3.3.2 p53蛋白的純化41-42
• 3.3.3 p53蛋白對(duì)線粒體的直接作用42-45
• 第4章 p53在細(xì)胞內(nèi)向線粒體的遷移效應(yīng)45-56
• 4.1 材料與設(shè)備45-47
• 4.1.1 主要試劑45-46
• 4.1.2 主要抗體46
• 4.1.3 主要儀器與設(shè)備46-47
• 4.2 實(shí)驗(yàn)方法47-51
• 4.2.1 細(xì)胞株47
• 4.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)試劑的配制47-48
• 4.2.3 胰酶配制48
• 4.2.4 磷酸鹽緩沖液（PBS）48
• 4.2.5 細(xì)胞凍存及復(fù)蘇48
• 4.2.6 細(xì)胞組分分離48-49
• 4.2.7 內(nèi)源p53蛋白的線粒體遷移49
• 4.2.8 外源p53重組質(zhì)粒的細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染49-50
• 4.2.9 Western Blot50-51
• 4.3 結(jié)果與分析51-56
• 4.3.1 內(nèi)源p53蛋白的線粒體遷移51-52
• 4.3.2 外源p53的線粒體遷移52-53
• 4.3.3 外源p53全長(zhǎng)及片段向線粒體遷移53-56
• 第5章 總結(jié)56-59
• 附錄59-63
• 參考文獻(xiàn)63-70
• 致謝70

【相似文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 Yaffe M;Schatz G;楊劍;;線粒體研究展望[J];國(guó)外醫(yī)學(xué)(分子生物學(xué)分冊(cè));1987年02期

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5 王s，

本文編號(hào)：573383