本文關(guān)鍵詞：神經(jīng)降壓素調(diào)控肝細胞肝癌上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的分子機制探討

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【摘要】：目的:探討神經(jīng)降壓素(neurotensin,NTS)與肝細胞肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)侵襲性和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)的關(guān)系及其相關(guān)分子機制。方法:隨機選取100例經(jīng)部分肝切除術(shù)治療的HCC患者石蠟組織切片標(biāo)本,同時收集患者的臨床病理資料。利用免疫組化方法分別檢測NTS,Ki67,E-cadherin、β-catenin、N-cadherin、Vimentin等EMT指標(biāo)的表達,并分析NTS與臨床病理指標(biāo)的相關(guān)性。以Hep3B、Hep G2為基礎(chǔ),通過基因轉(zhuǎn)染技術(shù)和RNA干擾技術(shù)構(gòu)建不同NTR1表達水平的HCC細胞系。利用Brd U增殖實驗、MTT法、Annexin V凋亡實驗、劃痕修復(fù)實驗、Transwell侵襲實驗來觀察不同NTS處理和不同NTR1表達水平的細胞在增殖、凋亡、遷移、侵襲上的差異。通過Real-time PCR和Western Blot的方法分析不同處理組之間EMT相關(guān)指標(biāo)(E-cadherin、β-catenin、N-cadherin、Snail、Slug)表達水平上的差異。利用PCR芯片技術(shù)和Western Blot探究NTS調(diào)控肝癌細胞EMT的主要信號通路和分子機制。通過SR48692和TSW119分別阻斷NTS信號通路和經(jīng)典Wnt通路來觀察肝癌細胞EMT指標(biāo)和侵襲能力的變化。結(jié)果:HCC標(biāo)本中,NTS+標(biāo)本占19.00%,NTS表達與HCC患者包膜完整性和門靜脈癌栓侵潤等轉(zhuǎn)移相關(guān)指標(biāo)密切相關(guān)。并且NTS+HCC患者預(yù)后不良,其OS明顯短于NTS-HCC患者,NTS是影響HCC患者不良預(yù)后的獨立因素。NTS+標(biāo)本中E-cadeherin表達減少,β-catenin在細胞漿內(nèi)聚積,N-cadherin表達增多。NTS的表達水平與E-cadeherin的表達水平呈負相關(guān),與β-catenin和N-cadherin的表達水平呈正相關(guān)。外源性NTS刺激和高表達NTR1對Hep3B和Hep G2細胞的增殖與凋亡無影響,但可以顯著提高其劃痕修復(fù)率和侵襲細胞數(shù)。同時外源性NTS刺激和高表達NTR1可以促進HCC細胞EMT,表現(xiàn)為降低Hep3B和Hep G2細胞中E-cadeherin表達,提高β-catenin、N-cadherin和Snail的表達。給予外源性NTS和提高NTR1表達量可以提高Wnt/β-catenin通路中Wnt1、Wnt3、Wnt5、Axin、p-GSK3β以及β-catenin的表達。SR48692和TSW119阻斷可以逆轉(zhuǎn)EMT過程造成E-cadeherin表達升高,β-catenin和N-cadherin表達降低,同時降低Wnt通路中的Wnt3、Axin、p-GSK3β以及β-catenin表達以及HCC細胞的遷移和侵襲力。結(jié)論:HCC組織中NTS高表達與肝癌高侵襲和不良預(yù)后相關(guān),外源性NTS刺激和高表達NTR1可以通過激活Wnt/β-catenin通路促進HCC細胞發(fā)生EMT來增強其侵襲性。
【關(guān)鍵詞】：神經(jīng)降壓素 原發(fā)性肝細胞肝癌 上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化 Wnt/β-catenin 通路
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R735.7
【目錄】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-11
• 縮略語/符號說明11-12
• 前言12-14
• 研究現(xiàn)狀、成果12-13
• 研究目的、方法13-14
• 一、HCC組織中NTS的表達及意義14-24
• 1.1 對象和方法14-16
• 1.1.1 病例來源14
• 1.1.2 標(biāo)本來源14-15
• 1.1.3 免疫組織化學(xué)染色試劑15
• 1.1.4 免疫組織化學(xué)染色15-16
• 1.1.5 統(tǒng)計學(xué)處理16
• 1.2 結(jié)果16-22
• 1.2.1 HCC癌組織及癌旁中NTS的表達情況16-17
• 1.2.2 NTS異常表達與患者臨床病理指標(biāo)的相關(guān)性17-18
• 1.2.3 NTS異常表達與HCC患者預(yù)后的相關(guān)性18-19
• 1.2.4 NTS異常表達與HCC細胞增殖和EMT的相關(guān)性19-22
• 1.3 討論22-23
• 1.4 小結(jié)23-24
• 二、HCC細胞系中NTS與EMT的相關(guān)研究24-54
• 2.1 對象和方法24-36
• 2.1.1 細胞系24
• 2.1.2 細胞培養(yǎng)試劑24
• 2.1.3 細胞轉(zhuǎn)染試劑24-25
• 2.1.4 細胞功能實驗試劑25
• 2.1.5 熒光實時定量PCR試劑25
• 2.1.6 Western Blot試劑25
• 2.1.7 ELISA試劑25
• 2.1.8 慢病毒基因轉(zhuǎn)染25-30
• 2.1.9 siRNA轉(zhuǎn)染30
• 2.1.10 細胞功能實驗30-32
• 2.1.11 熒光實時定量PCR32-33
• 2.1.12 Western Blot33-35
• 2.1.13 ELISA35-36
• 2.2 結(jié)果36-52
• 2.2.1 不同HCC細胞系內(nèi)NTS和NTR1的表達36-37
• 2.2.2 不同NTR1表達水平的HCC細胞系的構(gòu)建37-38
• 2.2.3 不同NTR1表達水平的HCC細胞中NTS的分泌量38-39
• 2.2.4 外源性NTS對不同NTR1表達水平的HCC細胞生長的影響39-44
• 2.2.5 外源性NTS對不同NTR1表達水平的HCC細胞侵襲的影響44-48
• 2.2.6 外源性NTS刺激和高表達NTR1促進HCC細胞EMT48-52
• 2.3 討論52-53
• 2.4 小結(jié)53-54
• 三、NTS促進HCC細胞EMT機制探討54-67
• 3.1 對象和方法54-56
• 3.1.1 細胞系54
• 3.1.2 細胞培養(yǎng)試劑54
• 3.1.3 PCR芯片相關(guān)試劑54
• 3.1.4 細胞轉(zhuǎn)導(dǎo)信號通路阻斷劑54
• 3.1.5 Western Blot試劑54-55
• 3.1.6 PCR芯片55-56
• 3.1.7 細胞信號阻斷實驗56
• 3.2 結(jié)果56-65
• 3.2.1 外源性NTS刺激和高表達NTR1促進HCC細胞EMT與Wnt通路激活有關(guān)56-60
• 3.2.2 SR48692及TWS119對HCC細胞EMT和Wnt/β-catenin通路的影響60-63
• 3.2.3 SR48692及TWS119對HCC細胞侵襲性的影響63-65
• 3.3 討論65-66
• 3.4 小結(jié)66-67
• 結(jié)論67-68
• 參考文獻68-72
• 發(fā)表論文和參加科研情況說明72-73
• 附錄73-75
• 綜述 神經(jīng)降壓素/白介素8通路影響腫瘤上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的研究進展75-89
• 綜述參考文獻82-89
• 致謝89

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本文編號：571338