本文關(guān)鍵詞：EZH2調(diào)控人頭頸部鱗癌生長(zhǎng)的實(shí)驗(yàn)研究

  更多相關(guān)文章： EZH2 DZNEP MICU1 細(xì)胞凋亡 腫瘤生長(zhǎng) 人頭頸部鱗狀細(xì)胞癌

【摘要】：近年來(lái),頭頸部鱗癌的患病率逐漸增加。且頭頸部鱗癌患者的病情進(jìn)展較快,治療效果及預(yù)后均不理想。盡管對(duì)于頭頸部鱗癌的診斷與治療方面已經(jīng)有了明顯的發(fā)展與突破,但是每年死于頭頸部鱗癌的患者仍很多。因此研究頭頸部鱗癌細(xì)胞的生長(zhǎng),尋找頭頸部鱗狀細(xì)胞癌新的有效治療靶點(diǎn)是當(dāng)前改善頭頸部鱗癌患者治療效果的重要突破口。Zest同源增強(qiáng)子(EZH2)是組成多梳蛋白PRC2復(fù)合物的核心亞基,它可以催化組蛋白H3K27三甲基化介導(dǎo)其下游靶基因轉(zhuǎn)錄沉默,其中腫瘤的發(fā)生與發(fā)展過(guò)程中尤為重要。EZH2如何調(diào)控腫瘤細(xì)胞凋亡的報(bào)道并不多,對(duì)于EZH2影響頭頸部鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞凋亡和腫瘤生長(zhǎng)的報(bào)道更屬空白。線粒體鈣離子攝入蛋白1(MICU1)是線粒體依賴性死亡途徑的負(fù)調(diào)控因子。本文采用通過(guò)采用EZH2的小分子抑制劑DZNEP抑制頭頸部鱗癌細(xì)胞表達(dá)及功能作用,另外還選取MICU1的表達(dá)及干擾質(zhì)粒改變HNSCC細(xì)胞中MICU1的表達(dá)水平,對(duì)EZH2調(diào)控細(xì)胞凋亡以及腫瘤生長(zhǎng)的作用效果和機(jī)制進(jìn)行了以下體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)研究。研究共分為三部分:第一部分:對(duì)天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院的97例不同級(jí)別與分期的HNSCC組織標(biāo)本提取蛋白,運(yùn)用免疫組化染色法檢測(cè)組織標(biāo)本切片中EZH2的定位及表達(dá)情況。結(jié)合癌癥基因組圖譜(TCGA)的生存分析研究HNSCC中EZH2表達(dá)水平與HNSCC不良預(yù)后的相關(guān)性。采用Western blot方法檢測(cè)5個(gè)HNSCC細(xì)胞系EZH2及MICU1蛋白的表達(dá)情況。第二部分:MTT法測(cè)定DZNEP對(duì)兩舌癌細(xì)胞的半數(shù)致死量(IC50)及對(duì)細(xì)胞活性的抑制能力;平板克隆實(shí)驗(yàn)檢測(cè)DZNEP對(duì)單個(gè)細(xì)胞的克隆形成能力的影響;Western blot檢測(cè)細(xì)胞株DZNEP處理后相關(guān)蛋白的表達(dá)變化。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡比率以及細(xì)胞周期的分布情況;β-半乳糖苷酶染色法檢測(cè)抑制EZH2的表達(dá)后HNSCC細(xì)胞的衰老數(shù)目變化;JC-1熒光探針檢測(cè)HNSCC細(xì)胞中EZH2受到抑制后線粒體膜電位的喪失情況;鈣離子熒光探針檢測(cè)HNSCC細(xì)胞中EZH2受到抑制后細(xì)胞漿內(nèi)鈣離子的濃度變化;Western blot分別檢測(cè)細(xì)胞凋亡、周期相關(guān)蛋白及MICU1的表達(dá)變化。以上實(shí)驗(yàn)研究抑制EZH2的表達(dá)水平后,HNSCC細(xì)胞體外生長(zhǎng)受到抑制的效果。為進(jìn)一步探究EZH2/MICU1調(diào)控線粒體死亡通路影響腫瘤生長(zhǎng)的機(jī)制。選用MICU1 Sh RNA敲低兩個(gè)HNSCC細(xì)胞系中的MICU1水平;流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡的比例;鈣離子熒光探針檢測(cè)HNSCC細(xì)胞中MICU1受到抑制后細(xì)胞漿內(nèi)鈣離子的濃度變化,JC-1熒光探針檢測(cè)HNSCC細(xì)胞中MICU1受到抑制后線粒體膜電位的喪失情況,Western blot分別檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白及MICU1的表達(dá)變化。同時(shí)選用MICU1過(guò)表達(dá)質(zhì)粒(GV230-MICU1)升高Hep-2的MICU1的水平,檢測(cè)其凋亡變化。第三部分:建立HNSCC Cal27裸鼠皮下荷瘤動(dòng)物模型,瘤內(nèi)注射DZNEP,密切觀察腫瘤生長(zhǎng)情況,免疫組化檢測(cè)HNSCC生長(zhǎng)相關(guān)蛋白的變化情況,檢測(cè)腫瘤組織凋亡比率,進(jìn)一步驗(yàn)證體外的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。結(jié)果:97例標(biāo)本的免疫組化結(jié)果顯示,在HNSCC中EZH2處于高表達(dá)狀態(tài),并且級(jí)別越高EZH2的表達(dá)水平越高,并且其預(yù)后較差。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示在5種細(xì)胞系中Cal27和SCC25中EZH2和MICU1的表達(dá)均相對(duì)較高。Cal27、SCC25細(xì)胞DZNEP的IC50分別為6和3μmol/L。體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,DZNEP處理后,能夠明顯抑制細(xì)胞的活性,抑制細(xì)胞增殖,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡及衰老;EZH2表達(dá)水平的改變破壞了細(xì)胞線粒體膜電位的穩(wěn)定性;鈣離子探針檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度明顯增加;Western blot結(jié)果表明示MICU1的表達(dá)明顯受到DZNEP的抑制。敲低MICU1的表達(dá)水平后,細(xì)胞早期凋亡比率增高;細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度顯著升高;線粒體膜電位水平喪失;凋亡相關(guān)蛋白的變化與抑制EZH2表達(dá)后變化一致。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)觀察結(jié)束時(shí),DZNEP處理組裸鼠荷瘤體積明顯小于其各自的無(wú)義對(duì)照組,腫瘤質(zhì)量明顯低于對(duì)照組。免疫組織化學(xué)染色結(jié)果示,DZNEP組中BAX、Cleaved Caspase-3表達(dá)水平增加,抗凋亡蛋白的表達(dá)水平受到抑制;TUNEL結(jié)果顯示,DZNEP能夠誘導(dǎo)體內(nèi)腫瘤細(xì)胞凋亡凋亡。體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。結(jié)論:1.EZH2在頭頸部鱗癌標(biāo)本中高表達(dá)提示患者預(yù)后不良。2.DZNEP可以通過(guò)抑制EZH2的功能作用,進(jìn)而抑制MICU1的表達(dá)水平,參與調(diào)控頭頸部鱗癌細(xì)胞線粒體途徑凋亡。3.DZNEP可以抑制人HNSCC細(xì)胞Cal27裸鼠荷瘤模型的生長(zhǎng);EZH2的抑制劑將可能成為HNSCC新的治療靶點(diǎn)。
【關(guān)鍵詞】：EZH2 DZNEP MICU1 細(xì)胞凋亡 腫瘤生長(zhǎng) 人頭頸部鱗狀細(xì)胞癌
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R739.91
【目錄】：

• 中文摘要4-7
• Abstract7-12
• 縮略語(yǔ)/符號(hào)說(shuō)明12-13
• 前言13-16
• 研究現(xiàn)狀、成果13-14
• 研究目的、方法14-16
• 一、EZH2在頭頸部鱗癌中高表達(dá)且提示患者預(yù)后不良16-23
• 1.1 對(duì)象和方法16-18
• 1.1.1 實(shí)驗(yàn)對(duì)象及材料16
• 1.1.2 實(shí)驗(yàn)方法16-17
• 1.1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析處理17-18
• 1.2 結(jié)果18-20
• 1.2.1 頭頸部鱗癌組織標(biāo)本中EZH2的表達(dá)及定位18-19
• 1.2.2 TCGA數(shù)據(jù)分析EZH2與頭頸部鱗癌的生存與腫瘤級(jí)別的關(guān)系19-20
• 1.3 討論20-22
• 1.4 小結(jié)22-23
• 二、抑制EZH2及MICU1影響頭頸部鱗癌細(xì)胞生長(zhǎng)的體外研究23-53
• 2.1 對(duì)象和方法23-29
• 2.1.1 實(shí)驗(yàn)對(duì)象及材料23-24
• 2.1.2 實(shí)驗(yàn)方法24-29
• 2.1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理29
• 2.2 結(jié)果29-50
• 2.2.1 Wstern blot檢測(cè)頭頸部鱗癌細(xì)胞系中EZH2等蛋白的表達(dá)水平29-30
• 2.2.2 MTT法檢測(cè)頭頸部鱗癌細(xì)胞DZNEP半數(shù)抑制濃度IC50值30-31
• 2.2.3 Western blot法檢測(cè)抑制EZH2后EZH2等蛋白的表達(dá)變化31-32
• 2.2.4 MTT法檢測(cè)DZNEP對(duì)細(xì)胞增殖能力的影響32
• 2.2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)DZNEP處理后對(duì)細(xì)胞周期的變化32-34
• 2.2.6 平板克隆法檢測(cè)DZNEP處理后對(duì)細(xì)胞增殖能力的影響34
• 2.2.7 Western blot法檢測(cè)DZNEP處理后細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的變化34-35
• 2.2.8 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)抑制EZH2后對(duì)細(xì)胞凋亡率的變化35-37
• 2.2.9 β-半乳糖苷酶染色檢測(cè)抑制EZH2后細(xì)胞衰老率的變化37-39
• 2.2.10 Western blot法檢測(cè)抑制EZH2后細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的變化39-40
• 2.2.11 JC-1 探針染色法檢測(cè)抑制EZH2后細(xì)胞線粒體膜電位的變化40-42
• 2.2.12 鈣離子探針?lè)z測(cè)DZNEP處理后細(xì)胞鈣離子濃度的變化42-43
• 2.2.13 檢測(cè)能夠有效敲低兩細(xì)胞系MCIU1表達(dá)的質(zhì)粒序列43-44
• 2.2.14 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)敲低MICU1后對(duì)細(xì)胞凋亡率的變化44-45
• 2.2.15 鈣離子探針?lè)z測(cè)敲低MICU1后細(xì)胞鈣離子濃度的變化45-46
• 2.2.16 JC-1 探針染色法檢測(cè)敲低MICU1后細(xì)胞線粒體膜電位的變化46-47
• 2.2.17 Western blot法檢測(cè)敲低MICU1后細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的變化47-48
• 2.2.18 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)過(guò)表達(dá)Hep-2 中MICU1后細(xì)胞凋亡率的變化48-49
• 2.2.19 Western blot法檢測(cè)過(guò)表達(dá)MICU1后細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的變化49-50
• 2.3 討論50-52
• 2.4 小結(jié)52-53
• 三、EZH2抑制劑抑制裸鼠荷頭頸部鱗癌細(xì)胞Cal27生長(zhǎng)的體內(nèi)研究53-60
• 3.1 對(duì)象和方法53-54
• 3.1.1 實(shí)驗(yàn)對(duì)象及材料53
• 3.1.2 實(shí)驗(yàn)方法53-54
• 3.1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理54
• 3.2 結(jié)果54-58
• 3.2.1 抑制劑DZNEP對(duì)裸鼠荷瘤生長(zhǎng)的影響54-56
• 3.2.2 治療后腫瘤相關(guān)指標(biāo)變化情況56-57
• 3.2.3 TUNEL 法檢測(cè)腫瘤組織凋亡57-58
• 3.3 討論58-59
• 3.4 小結(jié)59-60
• 結(jié)論60-61
• 參考文獻(xiàn)61-67
• 發(fā)表論文和參加科研情況說(shuō)明67-68
• 綜述68-77
• 綜述參考文獻(xiàn)72-77
• 致謝77-79
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷79

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本文編號(hào)：568909