本文關(guān)鍵詞：EZH2調(diào)控人頭頸部鱗癌生長的實驗研究

  更多相關(guān)文章： EZH2 DZNEP MICU1 細胞凋亡 腫瘤生長 人頭頸部鱗狀細胞癌

【摘要】：近年來,頭頸部鱗癌的患病率逐漸增加。且頭頸部鱗癌患者的病情進展較快,治療效果及預后均不理想。盡管對于頭頸部鱗癌的診斷與治療方面已經(jīng)有了明顯的發(fā)展與突破,但是每年死于頭頸部鱗癌的患者仍很多。因此研究頭頸部鱗癌細胞的生長,尋找頭頸部鱗狀細胞癌新的有效治療靶點是當前改善頭頸部鱗癌患者治療效果的重要突破口。Zest同源增強子(EZH2)是組成多梳蛋白PRC2復合物的核心亞基,它可以催化組蛋白H3K27三甲基化介導其下游靶基因轉(zhuǎn)錄沉默,其中腫瘤的發(fā)生與發(fā)展過程中尤為重要。EZH2如何調(diào)控腫瘤細胞凋亡的報道并不多,對于EZH2影響頭頸部鱗狀細胞癌細胞凋亡和腫瘤生長的報道更屬空白。線粒體鈣離子攝入蛋白1(MICU1)是線粒體依賴性死亡途徑的負調(diào)控因子。本文采用通過采用EZH2的小分子抑制劑DZNEP抑制頭頸部鱗癌細胞表達及功能作用,另外還選取MICU1的表達及干擾質(zhì)粒改變HNSCC細胞中MICU1的表達水平,對EZH2調(diào)控細胞凋亡以及腫瘤生長的作用效果和機制進行了以下體內(nèi)外實驗研究。研究共分為三部分:第一部分:對天津醫(yī)科大學腫瘤醫(yī)院的97例不同級別與分期的HNSCC組織標本提取蛋白,運用免疫組化染色法檢測組織標本切片中EZH2的定位及表達情況。結(jié)合癌癥基因組圖譜(TCGA)的生存分析研究HNSCC中EZH2表達水平與HNSCC不良預后的相關(guān)性。采用Western blot方法檢測5個HNSCC細胞系EZH2及MICU1蛋白的表達情況。第二部分:MTT法測定DZNEP對兩舌癌細胞的半數(shù)致死量(IC50)及對細胞活性的抑制能力;平板克隆實驗檢測DZNEP對單個細胞的克隆形成能力的影響;Western blot檢測細胞株DZNEP處理后相關(guān)蛋白的表達變化。流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡比率以及細胞周期的分布情況;β-半乳糖苷酶染色法檢測抑制EZH2的表達后HNSCC細胞的衰老數(shù)目變化;JC-1熒光探針檢測HNSCC細胞中EZH2受到抑制后線粒體膜電位的喪失情況;鈣離子熒光探針檢測HNSCC細胞中EZH2受到抑制后細胞漿內(nèi)鈣離子的濃度變化;Western blot分別檢測細胞凋亡、周期相關(guān)蛋白及MICU1的表達變化。以上實驗研究抑制EZH2的表達水平后,HNSCC細胞體外生長受到抑制的效果。為進一步探究EZH2/MICU1調(diào)控線粒體死亡通路影響腫瘤生長的機制。選用MICU1 Sh RNA敲低兩個HNSCC細胞系中的MICU1水平;流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡的比例;鈣離子熒光探針檢測HNSCC細胞中MICU1受到抑制后細胞漿內(nèi)鈣離子的濃度變化,JC-1熒光探針檢測HNSCC細胞中MICU1受到抑制后線粒體膜電位的喪失情況,Western blot分別檢測凋亡相關(guān)蛋白及MICU1的表達變化。同時選用MICU1過表達質(zhì)粒(GV230-MICU1)升高Hep-2的MICU1的水平,檢測其凋亡變化。第三部分:建立HNSCC Cal27裸鼠皮下荷瘤動物模型,瘤內(nèi)注射DZNEP,密切觀察腫瘤生長情況,免疫組化檢測HNSCC生長相關(guān)蛋白的變化情況,檢測腫瘤組織凋亡比率,進一步驗證體外的實驗結(jié)果。結(jié)果:97例標本的免疫組化結(jié)果顯示,在HNSCC中EZH2處于高表達狀態(tài),并且級別越高EZH2的表達水平越高,并且其預后較差。實驗結(jié)果顯示在5種細胞系中Cal27和SCC25中EZH2和MICU1的表達均相對較高。Cal27、SCC25細胞DZNEP的IC50分別為6和3μmol/L。體外實驗結(jié)果表明,DZNEP處理后,能夠明顯抑制細胞的活性,抑制細胞增殖,誘導細胞凋亡及衰老;EZH2表達水平的改變破壞了細胞線粒體膜電位的穩(wěn)定性;鈣離子探針檢測細胞內(nèi)Ca2+濃度明顯增加;Western blot結(jié)果表明示MICU1的表達明顯受到DZNEP的抑制。敲低MICU1的表達水平后,細胞早期凋亡比率增高;細胞內(nèi)Ca2+濃度顯著升高;線粒體膜電位水平喪失;凋亡相關(guān)蛋白的變化與抑制EZH2表達后變化一致。體內(nèi)實驗觀察結(jié)束時,DZNEP處理組裸鼠荷瘤體積明顯小于其各自的無義對照組,腫瘤質(zhì)量明顯低于對照組。免疫組織化學染色結(jié)果示,DZNEP組中BAX、Cleaved Caspase-3表達水平增加,抗凋亡蛋白的表達水平受到抑制;TUNEL結(jié)果顯示,DZNEP能夠誘導體內(nèi)腫瘤細胞凋亡凋亡。體內(nèi)外實驗結(jié)果一致。結(jié)論:1.EZH2在頭頸部鱗癌標本中高表達提示患者預后不良。2.DZNEP可以通過抑制EZH2的功能作用,進而抑制MICU1的表達水平,參與調(diào)控頭頸部鱗癌細胞線粒體途徑凋亡。3.DZNEP可以抑制人HNSCC細胞Cal27裸鼠荷瘤模型的生長;EZH2的抑制劑將可能成為HNSCC新的治療靶點。
【關(guān)鍵詞】：EZH2 DZNEP MICU1 細胞凋亡 腫瘤生長 人頭頸部鱗狀細胞癌
【學位授予單位】：天津醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R739.91
【目錄】：

• 中文摘要4-7
• Abstract7-12
• 縮略語/符號說明12-13
• 前言13-16
• 研究現(xiàn)狀、成果13-14
• 研究目的、方法14-16
• 一、EZH2在頭頸部鱗癌中高表達且提示患者預后不良16-23
• 1.1 對象和方法16-18
• 1.1.1 實驗對象及材料16
• 1.1.2 實驗方法16-17
• 1.1.3 統(tǒng)計學分析處理17-18
• 1.2 結(jié)果18-20
• 1.2.1 頭頸部鱗癌組織標本中EZH2的表達及定位18-19
• 1.2.2 TCGA數(shù)據(jù)分析EZH2與頭頸部鱗癌的生存與腫瘤級別的關(guān)系19-20
• 1.3 討論20-22
• 1.4 小結(jié)22-23
• 二、抑制EZH2及MICU1影響頭頸部鱗癌細胞生長的體外研究23-53
• 2.1 對象和方法23-29
• 2.1.1 實驗對象及材料23-24
• 2.1.2 實驗方法24-29
• 2.1.3 統(tǒng)計學處理29
• 2.2 結(jié)果29-50
• 2.2.1 Wstern blot檢測頭頸部鱗癌細胞系中EZH2等蛋白的表達水平29-30
• 2.2.2 MTT法檢測頭頸部鱗癌細胞DZNEP半數(shù)抑制濃度IC50值30-31
• 2.2.3 Western blot法檢測抑制EZH2后EZH2等蛋白的表達變化31-32
• 2.2.4 MTT法檢測DZNEP對細胞增殖能力的影響32
• 2.2.5 流式細胞術(shù)檢測DZNEP處理后對細胞周期的變化32-34
• 2.2.6 平板克隆法檢測DZNEP處理后對細胞增殖能力的影響34
• 2.2.7 Western blot法檢測DZNEP處理后細胞周期相關(guān)蛋白的變化34-35
• 2.2.8 流式細胞術(shù)檢測抑制EZH2后對細胞凋亡率的變化35-37
• 2.2.9 β-半乳糖苷酶染色檢測抑制EZH2后細胞衰老率的變化37-39
• 2.2.10 Western blot法檢測抑制EZH2后細胞凋亡相關(guān)蛋白的變化39-40
• 2.2.11 JC-1 探針染色法檢測抑制EZH2后細胞線粒體膜電位的變化40-42
• 2.2.12 鈣離子探針法檢測DZNEP處理后細胞鈣離子濃度的變化42-43
• 2.2.13 檢測能夠有效敲低兩細胞系MCIU1表達的質(zhì)粒序列43-44
• 2.2.14 流式細胞術(shù)檢測敲低MICU1后對細胞凋亡率的變化44-45
• 2.2.15 鈣離子探針法檢測敲低MICU1后細胞鈣離子濃度的變化45-46
• 2.2.16 JC-1 探針染色法檢測敲低MICU1后細胞線粒體膜電位的變化46-47
• 2.2.17 Western blot法檢測敲低MICU1后細胞凋亡相關(guān)蛋白的變化47-48
• 2.2.18 流式細胞術(shù)檢測過表達Hep-2 中MICU1后細胞凋亡率的變化48-49
• 2.2.19 Western blot法檢測過表達MICU1后細胞凋亡相關(guān)蛋白的變化49-50
• 2.3 討論50-52
• 2.4 小結(jié)52-53
• 三、EZH2抑制劑抑制裸鼠荷頭頸部鱗癌細胞Cal27生長的體內(nèi)研究53-60
• 3.1 對象和方法53-54
• 3.1.1 實驗對象及材料53
• 3.1.2 實驗方法53-54
• 3.1.3 統(tǒng)計學處理54
• 3.2 結(jié)果54-58
• 3.2.1 抑制劑DZNEP對裸鼠荷瘤生長的影響54-56
• 3.2.2 治療后腫瘤相關(guān)指標變化情況56-57
• 3.2.3 TUNEL 法檢測腫瘤組織凋亡57-58
• 3.3 討論58-59
• 3.4 小結(jié)59-60
• 結(jié)論60-61
• 參考文獻61-67
• 發(fā)表論文和參加科研情況說明67-68
• 綜述68-77
• 綜述參考文獻72-77
• 致謝77-79
• 個人簡歷79

【相似文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 李曉輝;異舒泛藍淋巴顯像在16例頭頸部鱗癌中的應用[J];福建醫(yī)藥雜志;2003年06期

2 倪松;徐震綱;;進展期頭頸部鱗癌非手術(shù)治療的研究進展[J];實用癌癥雜志;2006年05期

3 儲大同;;晚期和區(qū)域性局部晚期頭頸部鱗癌的內(nèi)科治療進展[J];醫(yī)學研究雜志;2010年02期

4 A.D.King;D.K.W.Yeung;K.S.Bhatia;龍淼淼;;頭頸部鱗癌:擴散加權(quán)成像對于治療的預測和監(jiān)控研究[J];國際醫(yī)學放射學雜志;2010年06期

5 鄭家偉,賈學林;頭頸部鱗癌治療進展[J];國外醫(yī)學.口腔醫(yī)學分冊;1995年04期

6 于俊秀;尹海林;;老年人頭頸部鱗癌[J];國外醫(yī)學(老年醫(yī)學分冊);1996年03期

7 ;遺傳因素在頭頸部鱗癌起因方面的作用[J];國外醫(yī)學.耳鼻咽喉科學分冊;1997年04期

8 ;美國科學家的基因組測序分析揭示更多頭頸部鱗癌相關(guān)基因[J];生物學教學;2012年03期

9 陶澤璋,public．wh．hb．cn,劉劍鋒,肖伯奎,楊強,詹漢章;頭頸部鱗癌及癌旁組織端粒酶活性研究[J];癌癥;2000年07期

10 劉劍鋒,陶澤璋,楊強,肖伯奎,詹漢章;頭頸部鱗癌及癌旁組織端粒酶活性檢測[J];臨床耳鼻咽喉科雜志;2000年06期

中國重要會議論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 何小慧;;頭頸部鱗癌的內(nèi)科治療進展[A];第三屆中國腫瘤內(nèi)科大會教育集暨論文集[C];2009年

2 朱國培;;頭頸部鱗癌的綜合治療進展[A];2007第六屆全國放射腫瘤學學術(shù)年會論文集[C];2007年

3 張軍;;專題十六:頭頸部鱗癌分子靶向放免治療:現(xiàn)狀與未來[A];首屆浙江省青年核醫(yī)學與分子影像論壇暨浙江省第十三屆核醫(yī)學與放射醫(yī)學防護學術(shù)會議論文匯編[C];2013年

4 應學明;陳俊;湯聲波;;同步化放療聯(lián)合尼妥珠單抗治療局部晚期頭頸部鱗癌Ⅱ期臨床研究[A];江西省中醫(yī)、中西醫(yī)結(jié)合腫瘤學術(shù)交流會論文集[C];2012年

5 倪曉光;王貴齊;;窄帶成像技術(shù)在頭頸部鱗癌早期診斷中的應用[A];2010全國耳鼻咽喉頭頸外科中青年學術(shù)會議論文匯編[C];2010年

6 易俊林;高黎;黃曉東;羅京偉;李素艷;肖建平;張濤;徐國鎮(zhèn);;術(shù)前同步放化療在局部晚期頭頸部鱗癌治療中的Ⅲ期臨床研究[A];2007第六屆全國放射腫瘤學學術(shù)年會論文集[C];2007年

7 李小囡;;西妥昔單抗聯(lián)合化療治療頭頸部鱗癌初步研究[A];第八次全國口腔頜面—頭頸腫瘤會議論文匯編[C];2009年

8 許婷婷;胡超蘇;應紅梅;朱國培;吳永如;王孝深;孔琳;沈春英;;聯(lián)合西妥昔單抗綜合治療復發(fā)/轉(zhuǎn)移性頭頸部鱗癌[A];第六屆全國鼻咽癌學術(shù)大會論文匯編[C];2010年

9 王大章;張萍;李楊;鄭光勇;胡靜;;頭頸部鱗癌的多藥耐藥性——機理與對策[A];第一屆全國口腔頜面部腫瘤學術(shù)會議論文匯編[C];2001年

10 徐本義;王龍龍;;TNPP方案在頭頸部鱗癌術(shù)前化療34例分析[A];第四屆中國腫瘤學術(shù)大會暨第五屆海峽兩岸腫瘤學術(shù)會議論文集[C];2006年

中國重要報紙全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 湖南省腫瘤醫(yī)院頭頸科 陳杰;頭頸部鱗癌患者要定期復查[N];大眾衛(wèi)生報;2002年

2 朋復;單一紫杉醇治療頭頸部鱗癌療效一般[N];中國高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)導報;2001年

中國博士學位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 崔志濱;頭頸部鱗狀細胞癌中TRIM24和PLU-1基因的功能研究[D];上海交通大學;2014年

2 劉勇;內(nèi)鏡治療早期賁門癌、拉網(wǎng)篩查食管癌、頭頸部癌合并食管癌的相關(guān)研究[D];北京協(xié)和醫(yī)學院;2016年

3 徐偉;頭頸部鱗癌化療耐藥性與耐藥基因表達譜的相關(guān)性研究[D];中國協(xié)和醫(yī)科大學;2002年

4 徐金科;膠原受體DDR2在頭頸部鱗癌中的作用研究[D];第四軍醫(yī)大學;2013年

5 卞卡;MicroRNA-203在頭頸部鱗癌細胞中的生物學功能及作用機制的研究[D];第四軍醫(yī)大學;2014年

6 謝磊;頭頸部鱗癌對自然殺傷細胞Toll樣受體3表達的影響[D];浙江大學;2007年

7 朱文淵;神經(jīng)酰胺在頭頸部鱗狀細胞癌中作用和機制的研究[D];浙江大學;2014年

8 張彬;頸分區(qū)性清掃術(shù)治療頭頸部鱗癌的遠期療效分析[D];中國協(xié)和醫(yī)科大學;2002年

9 阮宏瑩;Dehydroxymethylepoxyquinimicin（DHMEQ）/核因子kappa B抑制劑對頭頸部鱗癌細胞增殖抑制作用的研究[D];天津醫(yī)科大學;2004年

10 左建宏;Bcl-2高表達誘導頭頸部鱗癌細胞部分EMT、促進其侵襲和轉(zhuǎn)移機制研究[D];中南大學;2012年

中國碩士學位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 林煒;自噬相關(guān)基因Beclin-1、葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白-1、缺氧誘導因子-1α在喉癌中表達及意義[D];浙江大學;2015年

2 張卓;頭頸部鱗癌中Parafibromin表達及其臨床病理意義[D];遼寧醫(yī)學院;2015年

3 尚藝泰;重組人血管內(nèi)皮抑制素聯(lián)合放化療治療局部晚期頭頸部鱗癌療效分析[D];昆明醫(yī)科大學;2016年

4 孔令平;EZH2調(diào)控人頭頸部鱗癌生長的實驗研究[D];天津醫(yī)科大學;2016年

5 蔣艷明;頭頸部鱗癌指南及下頜骨放射性骨壞死的循證研究[D];廣西醫(yī)科大學;2013年

6 趙明;成纖維細胞生長因子受體-3在頭頸部鱗癌中的表達及其意義[D];浙江大學;2003年

7 張昊;頭頸部鱗癌術(shù)后同步放化療的臨床療效觀察[D];山東大學;2009年

8 錢薇;局部晚期頭頸部鱗癌經(jīng)綜合治療取得的療效、預后相關(guān)因素和遠期器官功能的研究[D];復旦大學;2013年

9 周霞東;分子靶向治療在頭頸部鱗癌的臨床應用進展[D];蘭州大學;2010年

10 李立;西妥昔單抗聯(lián)合放療治療頭頸部鱗癌臨床觀察[D];中南大學;2010年

，

本文編號：568909