本文關鍵詞：T-Synthase對卵巢上皮性癌中相關TCAC表達的影響及相關功能研究

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【摘要】：研究背景卵巢癌是女性生殖器官常見腫瘤之一,病死率幾乎占婦科腫瘤之首,對婦女的生命造成嚴重威脅。由于卵巢癌具有起病隱匿、易轉移、預后差等特點,大約3/4的患者就診時已屬晚期。手術治療聯(lián)合化療能一定的延長患者生存期,但卵巢癌的死亡率和復發(fā)率仍然較高,五年生存率仍然較低,因此,臨床上迫切需要新的能用于卵巢癌早期診斷和治療的分子標志物,尋找新的卵巢癌相關分子是目前研究的熱點和重點。目前,臨床上診斷癌癥主要依賴于影像,生物標志物,臨床分期以及其他的一些病理學分析,細胞的生物學功能發(fā)生改變被認為是癌癥發(fā)生的標志。現(xiàn)在人們普遍認識到蛋白質和脂類的糖基化發(fā)生改變也可以作為腫瘤發(fā)生的標志,如CA-125,Tn和Sialyl Tn,它們都是糖基化蛋白,經常作為生物學標志物來診斷癌癥。其中,Tn抗原是一種腫瘤相關碳水化合物抗原,通常不在外圍的組織和血細胞中表達,但是卻在人類各種類型的癌細胞中表達,Tn抗原主要來源于一個正常的O-糖基化通路,即聚糖從共同的前體GalNAcα1-O-絲氨酸/蘇氨酸擴展受到阻塞。該前體是在高爾基體中由一個家族多肽的產生的α-N-乙酰氨基半乳糖(ppGalNAcTs)糖蛋白,然后延伸到由單個酶稱為T合酶(核心1β3半乳糖或C1GalT)組成的共同的核心O聚糖galβ1-3galnacα1-oser/蘇氨酸(t抗原)。形成的t-合酶活性形式需要獨特的分子伴侶稱為cosmc,該cosmc(xq24在人類,xc3小鼠)在x染色體上編碼。cosmc駐留在內質網(wǎng)(er),并防止錯誤折疊,聚集新合成的t-合酶,防止蛋白酶體的降解。活性的t-合酶或cosmc的表達缺失可導致tn抗原的表達,以及影響它的唾液酸化的唾液酸t(yī)n抗原在大多數(shù)腫瘤中表達。目前關于腫瘤相關性碳水化合物抗原在卵巢癌中的研究尚不多見,t-synthase,t,tn和s-tn在卵巢癌以及正常卵巢組織中的表達情況如何,它們定位于何處,以及它們與分子伴侶cosmc基因有何密切的關系,它們在腫瘤的形成過程中起著什么關鍵性的作用,這都有待我們通過實驗來進行研究。目的1.明確t-synthase、t、tn和s-tn抗原在卵巢上皮性癌組織及正常卵巢組織中的表達及分布;2.明確t-synthase、t、tn和s-tn抗原在卵巢癌細胞系中的表達;3.明確不同表達狀態(tài)下的cosmc在卵巢癌細胞中的生物學功能。方法1.收集卵巢上皮性癌組織切片和卵巢上皮性癌新鮮組織,通過免疫組織化學和westernblot的方法檢測卵巢上皮性癌組織和正常卵巢組織中t-synthase、t、tn和s-tn抗原的分布和表達;2.通過培養(yǎng)兩種卵巢癌細胞系,制作細胞爬片,運用免疫細胞化學的方法檢測卵巢癌細胞中t-synthase、t、tn和s-tn抗原的分布和表達,同時,運用westernblot的方法檢測卵巢癌細胞系中t-synthase、t、tn和s-tn抗原的表達情況;3.構建cosmc過表達慢病毒載體,轉染卵巢癌細胞后,通過westernblot的方法檢測細胞系中t-synthase、t、tn和s-tn抗原分子表達的變化,闡明t-synthase唯一分子伴侶cosmc表達的高低對tcac表達的影響,然后,通過mtt法和流式細胞儀檢測cosmc表達對卵巢癌細胞生長和凋亡的影響,運用transwell實驗檢測cosmc表達對卵巢癌細胞遷移和侵襲能力的影響。結果1.正常卵巢組織和卵巢上皮性癌組織中t-synthase、t、tn、s-tn抗原的表達。運用免疫組織化學實驗對60例癌組織和20例正常組織進行t-synthase、t、tn、s-tn抗原表達的檢測,實驗結果發(fā)現(xiàn),t-synthase主要定位于細胞質,其在卵巢上皮性癌組織中的表達較正常組織明顯下調;t抗原主要定位于腺腔表面和外周細胞表面,其在卵巢上皮性癌組織中的表達較正常組織明顯下降;tn抗原主要存在于胞漿內,其在卵巢上皮性癌組織中的表達較正常組織明顯增高;s-tn抗原主要定位于胞漿內,在卵巢上皮性癌組織中,s-tn抗原的表達較正常組織明顯上升。westernblotting實驗對20例新鮮正常卵巢組織與48例卵巢上皮性癌組織樣本進行t-synthase、t、tn、s-tn抗原表達的檢測,實驗結果表明,在卵巢上皮性癌組織中t-synthase和t抗原的表達較正常組織明顯下調,而tn、s-tn的表達在卵巢上皮性癌組織中較正常組織上升明顯,此結果與免疫組化結果一致。2.卵巢癌細胞系skov3和a2780中t-synthase、t、tn和s-tn抗原的表達。免疫細胞化學實驗對卵巢癌細胞系skov3和a2780細胞爬片中t-synthase、t、tn和s-tn抗原的表達進行檢測,結果表明,t-synthase、t抗原在skov3和a2780細胞中呈現(xiàn)低表達或不表達,而tn和s-tn抗原在skov3和a2780細胞中出現(xiàn)中度表達或高表達,且s-tn比tn的陽性率和敏感性更高。westernblotting檢測卵巢癌細胞skov3、a2780中cosmc、t-synthase、t、tn和s-tn抗原的表達。實驗結果表明,cosmc、t-synthase、t抗原表達在卵巢癌細胞中均不高,而tn和s-tn抗原在skov3、a2780細胞呈高表達,此實驗結果與免疫細胞化學實驗的結果一致,表明t-synthase活性的降低抑制了t抗原的表達。3.cosmc過表達對相關分子表達的影響以及其在卵巢癌細胞中的生物學功能。卵巢癌細胞a2780和skov3培養(yǎng)后,轉染cosmc慢病毒,熒光顯微鏡下測轉染效率,熒光強度高,轉染效果在80%以上。同時,采用westernblot檢測cosmc的表達,轉染cosmc慢病毒的細胞組較轉染空白對照的細胞,cosmc的表達量明顯增加,且提高量大于2倍。通過westernblot檢測cosmc過表達后,t-synthase、t、tn、s-tn抗原的表達的變化,其結果表明,過表達cosmc后,其分子伴侶t-synthase的表達顯著上升,且T抗原的表達也相應增加,而相應的Tn和S-Tn抗原的表達則受到抑制,表明Cosmc可通過上調T-Synthase從而促進T抗原的形成,并抑制Tn和S-Tn抗原的表達。通過流式細胞儀檢測轉染Cosmc慢病毒的Skov3和A2780細胞的凋亡數(shù)。實驗結果表明,Cosmc過表達的卵巢癌細胞Skov3+和A2780+的凋亡數(shù)較對照組細胞Skov3和A2780明顯增加,通過MTT法檢測Cosmc對卵巢癌細胞生長能力的影響,結果表明,過表達Cosmc的細胞其生長能力明顯下降,此結果表明Cosmc過表達可促進卵巢癌細胞的凋亡并抑制其生長。通過分別對轉染Cosmc慢病毒的Skov3+和A2780+細胞進行Transwell實驗,以檢測Cosmc對卵巢癌細胞侵襲能力的影響,實驗結果表明,轉染Cosmc的細胞穿過小室膜的數(shù)量比對照組明顯減少,Cosmc過表達可抑制卵巢癌細胞的侵襲能力。結論1.T-Synthase、T抗原在卵巢上皮性癌組織中的表達較正常卵巢組織明顯下降,且在卵巢癌細胞系中呈低表達或不表達;Tn和S-Tn抗原在卵巢上皮性癌組織中的表達較正常卵巢組織明顯上升,且在卵巢癌細胞中呈現(xiàn)高表達。2.卵巢癌細胞系中過表達Cosmc基因可促進T-Synthase、T抗原的表達,且能抑制卵巢癌細胞的生長和侵襲及促進細胞凋亡。
【關鍵詞】：卵巢上皮性癌 腫瘤抗原 Cosmc T-Synthase
【學位授予單位】：第四軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R737.31
【目錄】：

• 縮略語表4-6
• 中文摘要6-10
• 英文摘要10-15
• 前言15-17
• 文獻回顧17-22
• 第一部分T-Synthase、T、Tn和S-Tn抗原在卵巢上皮性癌及正常卵巢組織中的表達分布22-37
• 1 材料22-26
• 2 方法26-29
• 3 結果29-35
• 4 討論35-37
• 第二部分T-Synthase、T、Tn和S-Tn抗原在卵巢癌 細胞系中的表達分布37-46
• 1 材料37-38
• 2 方法38-42
• 3 結果42-44
• 4 討論44-46
• 第三部分 不同表達狀態(tài)下Cosmc的生物學功能及與 卵巢癌細胞系中相關TCAC表達的相關性分析46-57
• 1 材料46-47
• 2 方法47-49
• 3 結果49-54
• 4 討論54-57
• 小結57-58
• 參考文獻58-66
• 個人簡歷和研究成果66-67
• 致謝67

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1 邸曼;T-Synthase對卵巢上皮性癌中相關TCAC表達的影響及相關功能研究[D];第四軍醫(yī)大學;2015年

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本文編號：565953