本文關(guān)鍵詞：卵巢癌相關(guān)抗原CA125膠體金免疫層析檢測方法的初步建立

  更多相關(guān)文章： CA125 膠體金免疫層析 卵巢癌

【摘要】：卵巢癌是女性生殖器最常見的三大惡性腫瘤之一,因其發(fā)病初期無典型臨床癥狀,多數(shù)患者就診時已處于患病晚期。因此,如何在卵巢癌發(fā)病早期準(zhǔn)確診斷就顯得尤為重要。研究發(fā)現(xiàn),糖類抗原125(Carbohydrate antigen 125,CA125)作為婦科臨床最常用的血清型腫瘤標(biāo)志物,對上皮性卵巢癌具有一定的特異性和敏感性,在卵巢癌的預(yù)防、輔助診斷、病情評估以及術(shù)后療效等方面具有非常積極的意義,可作為卵巢癌防治的主要監(jiān)測指標(biāo)。目前CA125的檢測技術(shù)主要有化學(xué)發(fā)光法及酶聯(lián)免疫法等,所使用的檢測試劑盒大多為昂貴的進口或國內(nèi)分裝試劑,且檢測時均需依賴相關(guān)檢測儀器在實驗室進行,檢測成本較高,不適合于基層醫(yī)院進行大規(guī)模初篩和床旁快檢。因此,急需尋找一種簡便、快速的檢測技術(shù),為臨床診斷提供依據(jù)。本研究采用正辛酸-硫酸銨沉淀法純化CA125包被和標(biāo)記單克隆抗體,經(jīng)透析后用紫外分光光度計測定280nm處吸光值,根據(jù)經(jīng)驗公式計算出兩種抗體的蛋白濃度,再通過SDS-PAGE對兩株抗體進行純度鑒定。采用檸檬酸三鈉還原法并控制檸檬酸三鈉加入量的不同而制備不同粒徑的膠體金,對其最適粒徑、膠體金制備工藝、標(biāo)記p H、最佳標(biāo)記蛋白量、金標(biāo)稀釋液加入量、硝酸纖維素膜、樣品墊處理液、劃膜液和最佳包被抗體量等因素進行選擇優(yōu)化,并對試紙條的穩(wěn)定性、特異性、靈敏度進行性能研究及實驗室臨床標(biāo)本評價,制備出能快速檢測人血清中CA125的膠體金檢測試紙。實驗結(jié)果表明,純化后獲得的抗體純度較高,其中每3m L抗體腹水純化后獲得1m L CA125包被抗體,濃度為14.93mg/m L,1.15m L標(biāo)記抗體,濃度為15.08mg/m L。采用的24.5nm膠體金顆粒相對均一,且性能穩(wěn)定。膠體金制備的最優(yōu)工藝為:加熱至沸騰時間8min,200rpm最大轉(zhuǎn)速,顏色穩(wěn)定后繼續(xù)加熱5min。通過反應(yīng)模式優(yōu)化,建立了膠體金檢測試紙條工藝:膠體金與蛋白標(biāo)記p H為7.5,標(biāo)記蛋白濃度為1.4mg/m L,金標(biāo)稀釋液加入量為300μL/m L,NC膜選用TEST NC膜,樣品墊處理液最佳配方組合為0.03M p H8.8 Tris、0.3%Tween-20、0.5%pvp、0.3%檸檬酸,質(zhì)控線和檢測線包被蛋白濃度1.5mg/m L,以此方法建立的試紙條靈敏度為35U/m L,且不與CEA、AFP、CA50、CA15-3、CA19-9發(fā)生交叉反應(yīng),37℃加速破壞實驗21d后顯示該試紙條穩(wěn)定性良好。臨床評價結(jié)果顯示:200份臨床標(biāo)本的檢測陽性符合率100/100,陰性符合率98/100。本研究成功建立了CA125膠體金免疫層析雙抗體夾心檢測方法,該檢測方法具有較高靈敏度、穩(wěn)定性、特異性。
【關(guān)鍵詞】：CA125 膠體金免疫層析 卵巢癌
【學(xué)位授予單位】：河南師范大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R446.6
【目錄】：

• 摘要4-6
• Abstract6-8
• 引言8-10
• 符號與縮略語10-14
• 第一章 綜述14-25
• 1.1 CA125概述14-16
• 1.1.1 CA125分子結(jié)構(gòu)14
• 1.1.2 CA125生物表達特性14-15
• 1.1.3 CA125基因結(jié)構(gòu)與功能15
• 1.1.4 CA125與卵巢癌的相關(guān)性15-16
• 1.2 CA125的檢測方法及其研究進展16-17
• 1.2.1 放射免疫分析法16
• 1.2.2 酶聯(lián)免疫法16
• 1.2.3 化學(xué)發(fā)光免疫分析16-17
• 1.2.4 免疫熒光分析法17
• 1.3 膠體金免疫層析快速檢測技術(shù)17-22
• 1.3.1 膠體金免疫層析技術(shù)的研究背景17-18
• 1.3.2 膠體金結(jié)構(gòu)特點及技術(shù)特性18-20
• 1.3.3 膠體金及膠體金標(biāo)記20-21
• 1.3.4 膠體金免疫層析技術(shù)發(fā)展前景21-22
• 1.4 本研究目的意義及主要內(nèi)容22-25
• 第二章 材料與方法25-46
• 2.1 實驗材料25-32
• 2.1.1 主要試劑及材料25-27
• 2.1.2 主要儀器設(shè)備27
• 2.1.3 主要溶液配置27-32
• 2.2 實驗方法32-46
• 2.2.1 CA125包被與標(biāo)記抗體純化及鑒定32-34
• 2.2.2 CA125膠體金免疫層析方法初步建立34-36
• 2.2.3 膠體金制備36-39
• 2.2.4 免疫金制備39-41
• 2.2.5 NC膜的選擇41
• 2.2.6 抗體包被41-42
• 2.2.7 樣品墊的處理42-44
• 2.2.8 CA125膠體免疫層析檢測試紙制備工藝的確定44
• 2.2.9 試紙條靈敏度實驗44-45
• 2.2.10 試紙條特異性實驗45
• 2.2.11 試紙條穩(wěn)定性實驗45
• 2.2.12 臨床標(biāo)本檢測45-46
• 第三章 實驗結(jié)果46-64
• 3.1 正辛酸-硫酸銨法腹水純化46
• 3.2 SDS-PAGE鑒定46-47
• 3.3 最適膠體金粒徑選擇結(jié)果47-48
• 3.4 膠體金制備工藝優(yōu)化結(jié)果48-49
• 3.5 膠體金質(zhì)量鑒定結(jié)果49-50
• 3.5.1 肉眼觀察49-50
• 3.5.2 紫外-可見分光光度計掃描結(jié)果50
• 3.5.3 透射電鏡觀察結(jié)果50
• 3.6 免疫金制備50-54
• 3.6.1 最適標(biāo)記p H51
• 3.6.2 最適標(biāo)記蛋白量51-53
• 3.6.3 金標(biāo)稀釋液加入量優(yōu)化結(jié)果53-54
• 3.7 NC膜的選擇結(jié)果54-55
• 3.7.1 不同NC膜的顯色結(jié)果比較54
• 3.7.2 不同濕度環(huán)境的顯色比較結(jié)果54-55
• 3.8 抗體包被55-56
• 3.8.1 劃膜液選擇結(jié)果55
• 3.8.2 包被抗體濃度優(yōu)化結(jié)果55-56
• 3.9 樣品墊的處理56-59
• 3.9.1 樣品墊處理與否對檢測結(jié)果的影響56-57
• 3.9.2 樣品墊處理液優(yōu)化結(jié)果57-59
• 3.10 CA125膠體免疫層析檢測試紙制備工藝的確定59-61
• 3.10.1 標(biāo)記59
• 3.10.2 包被59-60
• 3.10.3 組條60
• 3.10.4 切條60
• 3.10.5 檢測60-61
• 3.11 試紙條靈敏度確定61
• 3.12 試紙條特異性實驗結(jié)果61-62
• 3.13 穩(wěn)定性實驗結(jié)果62-63
• 3.14 臨床標(biāo)本檢測結(jié)果63-64
• 第四章 討論64-67
• 4.1 CA125試紙條制備方法的選擇64
• 4.2 膠體金制備工藝的確定64-65
• 4.3 最適標(biāo)記p H的選定65
• 4.4 CA125試紙條樣品墊處理液優(yōu)化65-66
• 4.5 劃膜液的優(yōu)化66-67
• 第五章 結(jié)論與展望67-68
• 5.1 結(jié)論67
• 5.2 未來工作及前景展望67-68
• 參考文獻68-74
• 致謝74-75
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文目錄75-76

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前5條

1 陳丹;孫廣瑞;柳增善;;辛酸-硫酸銨聯(lián)合沉淀法在單克隆抗體純化中的應(yīng)用[J];安徽農(nóng)業(yè)科學(xué);2007年26期

2 孔繁德,黃印堯,賴清金;免疫膠體金技術(shù)及其發(fā)展前景[J];福建畜牧獸醫(yī);2002年S1期

3 呂繩凱,劉煜凱;免疫膠體金的制備及應(yīng)用[J];上海醫(yī)學(xué)檢驗雜志;1990年01期

4 吳剛;姜瞻梅;霍貴成;田波;;膠體金免疫層析技術(shù)在食品檢測中的應(yīng)用[J];食品工業(yè)科技;2007年12期

5 朱梓華,朱濤,劉忠范;大粒徑單分散金納米粒子的水相合成[J];物理化學(xué)學(xué)報;1999年11期

中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 孫園園;膠體金免疫層析法聯(lián)合檢測EV71和CA16 IgM的研究[D];新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院;2014年

，

本文編號：562244