發(fā)布時間：2017-07-18 09:28

  本文關(guān)鍵詞：結(jié)腸癌細胞系中p53調(diào)控癌干細胞表面標(biāo)志物CD133表達及NU7026的輻射增敏作用研究

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【摘要】：目的:以結(jié)腸癌細胞系HCT116為主要研究對象,探究p53基因是否調(diào)控癌干細胞表面標(biāo)志物CD133的表達及作用機制,并研究DNA損傷響應(yīng)調(diào)控蛋白DNA-PKcs的抑制劑NU7026對結(jié)腸癌干細胞的放射增敏作用。方法:蛋白質(zhì)聚丙烯酰胺凝膠電泳免疫印跡雜交法(western blot),檢測細胞系中相關(guān)蛋白的表達;以癌干細胞表面標(biāo)志物CD133/CD44作為標(biāo)記,通過流式細胞術(shù)分別檢測p53野生型和p53突變型結(jié)腸癌細胞系中的癌干細胞亞群分布比例;實時定量RT-PCR(quantitative Real time-PCR)方法測定CD133和p53基因m RNA轉(zhuǎn)錄表達水平;通過瞬時基因轉(zhuǎn)染的方法將sh RNA表達質(zhì)�；騪53基因真核表達質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染入細胞,構(gòu)建干擾p53基因表達或者過表達p53基因的細胞模型;構(gòu)建CD133啟動子啟動熒光素酶標(biāo)記基因表達的重組質(zhì)粒;用化學(xué)發(fā)光儀檢測CD133啟動子轉(zhuǎn)錄雙熒光素酶活性。將含有高癌干細胞亞群比例的HCT116細胞系分成四個組:實驗對照組,20μmol/L NU7026作用組,2 Gyγ射線照射組,20μmol/L NU7026聯(lián)合2 Gy輻射組,γ射線照射前2小時加入NU7026后,通過細胞克隆形成實驗和MTT檢測HCT116細胞增殖變化;流式細胞術(shù)檢測細胞周期,細胞凋亡,癌干細胞亞群變化,免疫熒光激光共聚焦顯微鏡觀察各組細胞并統(tǒng)計其gH2AX foci點均數(shù)等,分析評價NU7026對高癌干細胞亞基比例的結(jié)腸癌HCT116細胞系的放射增敏作用及其DNA雙鏈斷裂損傷修復(fù)反應(yīng)的影響。結(jié)果:首先通過western blot驗證了p53野生型結(jié)腸癌細胞HCT116p53+/+和p53突變型結(jié)腸癌細胞HCT116p53-/-的p53表達狀態(tài),確保了實驗細胞模型的可靠性;CD133陽性亞群比例,在p53野生型細胞中高達84.84±0.05%,而在p53突變型細胞中只有4.13±0.02%;CD133基因m RNA轉(zhuǎn)錄表達檢測結(jié)果顯示,野生型細胞和突變型細胞的相對表達水平分別為0.16±0.041和0.0081±0.0039(t=6.29,P0.01),表明不同p53狀態(tài)的兩HCT116細胞系之間癌干細胞表面標(biāo)志物CD133的表達水平存在顯著差異;在HCT116p53+/+中,通過si RNA干擾技術(shù)抑制p53蛋白表達后,CD133轉(zhuǎn)錄表達水平也隨著下降,CD133陽性亞群比例也下降(從85.78±1.17%降至4.70±0.17%,t=119.79,P0.0001)。抑制p53表達,CD133啟動子的轉(zhuǎn)錄激活活性也顯著下降;在HCT116p53-/-細胞系中過表達外源的p53蛋白,CD133轉(zhuǎn)錄表達水平也隨之增加,為對照組的1.58倍。CD133啟動子轉(zhuǎn)錄激活活性明顯增加,且具有統(tǒng)計學(xué)意義。CD133亞群比例略增(從4.52±0.35%升至5.83±0.30%,t=4.92,P0.01);在293T細胞系中,分別轉(zhuǎn)染p53過表質(zhì)粒和p53干擾si RNA表達質(zhì)粒,檢測發(fā)現(xiàn)CD133啟動子活性隨p53蛋白的表達量增加而增加,或隨p53蛋白表達抑制而減少。在p53野生型結(jié)腸癌HCT116細胞試驗中,20μmol/L NU7026+2 Gy組與單獨2 Gyγ射線輻照組比較,顯示出NU7026的放射增敏作用:細胞增殖慢,細胞克隆形成率明顯下降(t=7.21,P0.01),存活率降低更加顯著(t=7.22,P0.01);照射后24小時G2/M期不可逆阻滯明顯增加(t=7.67,P0.01),在48小時,細胞早期凋亡率明顯增加(t=8.24,P0.05);作為DNA雙鏈斷裂分子標(biāo)記的細胞gH2AX foci的均數(shù)點明顯增多;更為重要的是,單獨照射后48 h,CD133陽性癌干細胞亞群比例還有所上升,提示癌干細胞更高的輻射抗性,而聯(lián)合NU7026的處理組,CD133陽性癌干細胞亞群比例降低,有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)論:實驗發(fā)現(xiàn)在結(jié)腸癌HCT116細胞中,p53正調(diào)控癌干細胞表面蛋白標(biāo)記物CD133的表達,與對其啟動子的轉(zhuǎn)錄激活作用有關(guān)。NU7026能降低癌細胞受g射線照射后的癌干細胞亞群比例,對癌干細胞為優(yōu)勢亞群的結(jié)腸癌HCT116細胞具有明顯的放射增敏作用,增敏機制是多方面,包括抑制DNA修復(fù)、誘發(fā)不可逆G2/M期阻滯、增加細胞凋亡發(fā)生。
【關(guān)鍵詞】：癌干細胞 P53 CD133 DNA-PKcs 結(jié)腸癌細胞
【學(xué)位授予單位】：南華大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R735.35
【目錄】：

• 摘要4-7
• Abstract7-14
• 第1章 緒論14-20
• 1.1 研究的背景14-18
• 1.1.1 癌干細胞的來源14-15
• 1.1.2 癌干細胞表面標(biāo)志物15-16
• 1.1.3 癌干細胞的鑒定和篩選16
• 1.1.4 CD133~+/CD44~+ 結(jié)腸癌干細胞對治療的耐受性16-17
• 1.1.5 癌干細胞耐輻射和耐藥性機制17
• 1.1.6 P53基因17-18
• 1.1.7 DNA-PKcs18
• 1.2 預(yù)實驗探索性研究提示18-20
• 第2章 材料與方法20-38
• 2.1 材料20-24
• 2.1.1 實驗室常用藥品試劑及配方20-21
• 2.1.2 抗體21-22
• 2.1.3 儀器及耗材22-23
• 2.1.4 其他23-24
• 2.2 方法24-34
• 2.2.1 細胞培養(yǎng)及傳代處理24
• 2.2.2 蛋白樣品的制備24-25
• 2.2.3 蛋白質(zhì)聚丙烯酰胺凝膠電泳免疫印跡雜交法25-27
• 2.2.4 QT-PCR實驗27-28
• 2.2.5 流式細胞術(shù)分析28-29
• 2.2.6 轉(zhuǎn)染實驗29-31
• 2.2.7 雙熒光素酶-報告基因?qū)嶒?/span>31-34
• 2.3 細胞克隆形成實驗34-35
• 2.4 MTT實驗35
• 2.5 流式細胞術(shù)實驗35-37
• 2.5.1 流式細胞儀檢測癌干細胞亞群比例35-36
• 2.5.2 細胞周期檢測36
• 2.5.3 細胞凋亡檢測36-37
• 2.6 免疫熒光激光共聚焦檢測γH2AX foci37
• 2.6.1 樣品收集及保存37
• 2.6.2 樣品處理37
• 2.7 統(tǒng)計學(xué)方法37-38
• 第3章 結(jié)果38-62
• 3.1 癌干細胞表面標(biāo)志物CD133蛋白在兩細胞系間的差異性38-39
• 3.1.1 兩細胞系中 CD133/CD44 癌干細胞亞群比例分析38-39
• 3.1.2 兩細胞系中CD133蛋白和mRNA水平表達差異性分析39
• 3.2 p53對癌干細胞表面標(biāo)志物CD133的調(diào)控39-43
• 3.3 CD133啟動子生物信息分析及報告基因重組載體43-45
• 3.4 p53基因?qū)D133啟動子轉(zhuǎn)錄活性的調(diào)節(jié)45-48
• 3.5 HCT116細胞系癌干細胞特性48-51
• 3.6 NU7026對HCT116細胞增殖的影響51-53
• 3.7 流式細胞術(shù)分析53-58
• 3.7.1 NU7026對CD133陽性亞群比例的影響53-54
• 3.7.2 NU7026對放射誘發(fā)HCT116細胞G2/M期阻滯的影響54-56
• 3.7.3 NU7026對放射誘發(fā)HCT116細胞凋亡的影響56-58
• 3.8 NU7026對放射誘發(fā)HCT116細胞DNA損傷修復(fù)的影響58-62
• 3.8.1 NU7026對放射誘發(fā)HCT116p53~(+/+)細胞DNA損傷修復(fù)的影響58-59
• 3.8.2 NU7026對放射誘發(fā)HCT116p53~(-/-)細胞DNA雙鏈斷裂損傷修復(fù)的影響59-62
• 第4章 討論62-68
• 4.1 p53基因正向調(diào)控CD133啟動子活性62-63
• 4.2 DNA-PKcs抑制劑NU7026對結(jié)腸癌細胞系γ射線的增敏作用63-68
• 第5章 結(jié)論68-70
• 參考文獻70-77
• 綜述77-88
• 參考文獻83-88
• 附錄88-92
• 作者攻讀學(xué)位期間的科研成果92-94
• 致謝94

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10 劉龔玫子;周，

本文編號：557076