本文關(guān)鍵詞：PLCE1基因缺失對食管鱗癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的影響

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【摘要】：背景食管癌是人類常見的一種惡性腫瘤,它的發(fā)生是一個(gè)涉及多因素、多基因的變異積累及相互作用的復(fù)雜過程,具有高發(fā)病率、高復(fù)發(fā)率和高死亡率。近來隨著大規(guī)模臨床隊(duì)列和全基因組關(guān)聯(lián)分析等研究證實(shí)磷脂酶Cε1(Phospholipase C Epsilon-1,PLCE1)基因可作為一個(gè)食管癌易感基因影響著食管腫瘤的發(fā)生發(fā)展。但目前對PLCE1在食管癌侵襲轉(zhuǎn)移和發(fā)生、發(fā)展中的具體作用機(jī)制尚不清楚。因此PLCE1的功能性研究對探討其在食管癌發(fā)展進(jìn)程中的機(jī)制具有重要意義。目的探討PLCE1對食管癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的影響,分析其與食管癌預(yù)后的關(guān)系,從而為食管癌的治療提供新的思路和方法。方法1.運(yùn)用CRISPR/CAS9基因編輯技術(shù),在食管鱗癌細(xì)胞EC-9706的兩個(gè)保守外顯子上設(shè)計(jì)sgRNA(特異性引導(dǎo)RNA),通過sgRNA的作用將Cas9核酸酶帶到基因組的相關(guān)具體靶點(diǎn)上,然后對其特定的基因位點(diǎn)進(jìn)行定點(diǎn)切割,將食管鱗癌中PLCE1基因進(jìn)行基因敲除。2.通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-time quantitative PCR,qPCR)和Western blotting方法檢測突變組(基因敲除)細(xì)胞與對照組(未進(jìn)行基因敲除)細(xì)胞中mRNA水平和蛋白水平的表達(dá)情況。3.結(jié)合劃痕、Migration遷移實(shí)驗(yàn)和Invasion侵襲實(shí)驗(yàn)觀察突變組細(xì)胞與對照組細(xì)胞在遷移、侵襲等方面的表型差異。4.應(yīng)用裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)觀察兩組移植瘤在移植生長動力學(xué)方面的差異。5.應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測突變組和對照組細(xì)胞的平均熒光強(qiáng)度。6.應(yīng)用Western blot檢測對照組和突變組細(xì)胞在基因敲除后其蛋白的表達(dá)變化;檢測上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子(Snail、β-catenin、Slug、ZO-1)在兩組細(xì)胞和兩組細(xì)胞移植瘤中的蛋白表達(dá)情況,進(jìn)而探討PLCE1與EMT在食管鱗癌預(yù)后中的功能性關(guān)聯(lián)。結(jié)果1.運(yùn)用CRISPR/Cas9系統(tǒng)成功將PLCE1基因進(jìn)行敲除。2.qPCR和Western blotting結(jié)果均顯示:食管鱗癌易感基因PLCE1在基因敲除之后對照組細(xì)胞的mRNA表達(dá)水平明顯高于突變組細(xì)胞(P0.01),且突變組細(xì)胞中的PLCE基因的蛋白表達(dá)水平完全缺失。3.劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明基因敲除后食管鱗癌細(xì)胞的遷移能力明顯降低(P0.01);Migration遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明突變組細(xì)胞遷移能力相較于對照組細(xì)胞顯著降低(P0.01),進(jìn)一步驗(yàn)證劃痕結(jié)果;Invasion侵襲實(shí)驗(yàn)中突變組細(xì)胞突破Metrigel膠的侵襲能力顯著降低(P0.01)。4.裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)的結(jié)果說明種植突變組細(xì)胞的瘤塊體積以及重量均明顯低于對照組移植瘤,其生長能力減弱(P0.01)。5.流式細(xì)胞儀的平均熒光強(qiáng)度的結(jié)果顯示EMT中Snail、ZO-1等轉(zhuǎn)錄因子在突變組細(xì)胞中呈低表達(dá),而在對照組細(xì)胞中則呈高表達(dá)(P0.001)。6.Western blot技術(shù)的結(jié)果表明突變組細(xì)胞中的蛋白表達(dá)缺失;EMT中轉(zhuǎn)錄因子Snail在對照組細(xì)胞中具有高表達(dá),而在突變型細(xì)胞中低表達(dá);突變組移植瘤中Snail等相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的蛋白表達(dá)明顯降低,這些結(jié)果從蛋白水平上進(jìn)一步說明了流式細(xì)胞儀檢測的結(jié)果。結(jié)論P(yáng)LCE1基因缺失能夠抑制食管鱗癌癌變中的侵襲和轉(zhuǎn)移等發(fā)展進(jìn)程,而EMT在該基因的調(diào)控下影響著食管鱗癌的相關(guān)功能變化。PLCE1基因與EMT的相互作用將是未來基因研究與基因治療的新方向。
【關(guān)鍵詞】：食管鱗癌 PLCE1 EMT 侵襲 轉(zhuǎn)移
【學(xué)位授予單位】：新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R735.1
【目錄】：

• 摘要5-7
• Abstract7-10
• 前言10-12
• 材料與方法12-20
• 結(jié)果20-26
• 討論26-33
• 小結(jié)33-34
• 參考文獻(xiàn)34-40
• 綜述：PLCE1基因多態(tài)性與EMT在腫瘤中的研究進(jìn)展40-55
• 參考文獻(xiàn)49-55
• 附錄A55-56
• 附錄B56-57
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表文章情況57-59
• 致謝59-60
• 個(gè)人簡歷60

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本文編號：555197