本文關鍵詞：PLCE1基因缺失對食管鱗癌細胞侵襲轉(zhuǎn)移的影響

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【摘要】：背景食管癌是人類常見的一種惡性腫瘤,它的發(fā)生是一個涉及多因素、多基因的變異積累及相互作用的復雜過程,具有高發(fā)病率、高復發(fā)率和高死亡率。近來隨著大規(guī)模臨床隊列和全基因組關聯(lián)分析等研究證實磷脂酶Cε1(Phospholipase C Epsilon-1,PLCE1)基因可作為一個食管癌易感基因影響著食管腫瘤的發(fā)生發(fā)展。但目前對PLCE1在食管癌侵襲轉(zhuǎn)移和發(fā)生、發(fā)展中的具體作用機制尚不清楚。因此PLCE1的功能性研究對探討其在食管癌發(fā)展進程中的機制具有重要意義。目的探討PLCE1對食管癌細胞侵襲和轉(zhuǎn)移的影響,分析其與食管癌預后的關系,從而為食管癌的治療提供新的思路和方法。方法1.運用CRISPR/CAS9基因編輯技術,在食管鱗癌細胞EC-9706的兩個保守外顯子上設計sgRNA(特異性引導RNA),通過sgRNA的作用將Cas9核酸酶帶到基因組的相關具體靶點上,然后對其特定的基因位點進行定點切割,將食管鱗癌中PLCE1基因進行基因敲除。2.通過實時熒光定量PCR(real-time quantitative PCR,qPCR)和Western blotting方法檢測突變組(基因敲除)細胞與對照組(未進行基因敲除)細胞中mRNA水平和蛋白水平的表達情況。3.結(jié)合劃痕、Migration遷移實驗和Invasion侵襲實驗觀察突變組細胞與對照組細胞在遷移、侵襲等方面的表型差異。4.應用裸鼠成瘤實驗觀察兩組移植瘤在移植生長動力學方面的差異。5.應用流式細胞儀檢測突變組和對照組細胞的平均熒光強度。6.應用Western blot檢測對照組和突變組細胞在基因敲除后其蛋白的表達變化;檢測上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)相關轉(zhuǎn)錄因子(Snail、β-catenin、Slug、ZO-1)在兩組細胞和兩組細胞移植瘤中的蛋白表達情況,進而探討PLCE1與EMT在食管鱗癌預后中的功能性關聯(lián)。結(jié)果1.運用CRISPR/Cas9系統(tǒng)成功將PLCE1基因進行敲除。2.qPCR和Western blotting結(jié)果均顯示:食管鱗癌易感基因PLCE1在基因敲除之后對照組細胞的mRNA表達水平明顯高于突變組細胞(P0.01),且突變組細胞中的PLCE基因的蛋白表達水平完全缺失。3.劃痕實驗結(jié)果表明基因敲除后食管鱗癌細胞的遷移能力明顯降低(P0.01);Migration遷移實驗結(jié)果表明突變組細胞遷移能力相較于對照組細胞顯著降低(P0.01),進一步驗證劃痕結(jié)果;Invasion侵襲實驗中突變組細胞突破Metrigel膠的侵襲能力顯著降低(P0.01)。4.裸鼠成瘤實驗的結(jié)果說明種植突變組細胞的瘤塊體積以及重量均明顯低于對照組移植瘤,其生長能力減弱(P0.01)。5.流式細胞儀的平均熒光強度的結(jié)果顯示EMT中Snail、ZO-1等轉(zhuǎn)錄因子在突變組細胞中呈低表達,而在對照組細胞中則呈高表達(P0.001)。6.Western blot技術的結(jié)果表明突變組細胞中的蛋白表達缺失;EMT中轉(zhuǎn)錄因子Snail在對照組細胞中具有高表達,而在突變型細胞中低表達;突變組移植瘤中Snail等相關轉(zhuǎn)錄因子的蛋白表達明顯降低,這些結(jié)果從蛋白水平上進一步說明了流式細胞儀檢測的結(jié)果。結(jié)論PLCE1基因缺失能夠抑制食管鱗癌癌變中的侵襲和轉(zhuǎn)移等發(fā)展進程,而EMT在該基因的調(diào)控下影響著食管鱗癌的相關功能變化。PLCE1基因與EMT的相互作用將是未來基因研究與基因治療的新方向。
【關鍵詞】：食管鱗癌 PLCE1 EMT 侵襲 轉(zhuǎn)移
【學位授予單位】：新鄉(xiāng)醫(yī)學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R735.1
【目錄】：

• 摘要5-7
• Abstract7-10
• 前言10-12
• 材料與方法12-20
• 結(jié)果20-26
• 討論26-33
• 小結(jié)33-34
• 參考文獻34-40
• 綜述：PLCE1基因多態(tài)性與EMT在腫瘤中的研究進展40-55
• 參考文獻49-55
• 附錄A55-56
• 附錄B56-57
• 攻讀學位期間發(fā)表文章情況57-59
• 致謝59-60
• 個人簡歷60

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