發(fā)布時(shí)間：2017-07-17 12:32

  本文關(guān)鍵詞：STOML-2抑制宮頸癌細(xì)胞鉑誘導(dǎo)凋亡的機(jī)制

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【摘要】：研究背景宮頸癌是全世界范圍內(nèi)第二高發(fā)的婦科腫瘤,僅僅次于乳腺癌。據(jù)最新統(tǒng)計(jì),全球每年新發(fā)宮頸癌病例約53萬(wàn)例,占新發(fā)癌癥總數(shù)量的9%,在女性因惡性腫瘤死亡的癌癥類型中排名第四位。宮頸癌多發(fā)生于經(jīng)濟(jì)水平相對(duì)欠發(fā)達(dá)的地區(qū),約85%的病例發(fā)生于發(fā)展中國(guó)家,59%發(fā)生于亞洲,其中,發(fā)展中國(guó)家年齡標(biāo)化死亡率為10/10000,遠(yuǎn)高于發(fā)達(dá)國(guó)家。隨著宮頸癌的預(yù)防篩查及手術(shù)、放化療等綜合治療日益完善,近年來(lái)宮頸癌的發(fā)病率及死亡率雖有所下降,但我國(guó)仍是宮頸癌的高發(fā)國(guó)家之一,每年新發(fā)病例達(dá)到11萬(wàn)以上,且呈現(xiàn)年輕化的趨勢(shì),每年因?qū)m頸癌死亡的女性高達(dá)2-3萬(wàn)。因此,宮頸癌仍是嚴(yán)重威脅女性健康并導(dǎo)致婦女死亡的惡性腫瘤之一。隨著對(duì)腫瘤發(fā)生發(fā)展分子機(jī)制研究的不斷深入,尋求臨床上敏感有效的診斷指標(biāo)和治療靶點(diǎn)是科研人員的研究重點(diǎn)。STOML-2,最初在人類紅細(xì)胞的膜蛋白發(fā)現(xiàn)而命名,其與人類多種疾病密切相關(guān),如腎衰竭和貧血等。STOML-2/SLP-2與其他口型蛋白家族成員一樣,擁有相同的序列,但不含有氨基末端疏水結(jié)構(gòu)域,這有別于其他家庭成員。自從2006年以來(lái),研究發(fā)現(xiàn)STOML-2在多種腫瘤組織高表達(dá),比如食管鱗狀細(xì)胞癌、膽囊癌、喉鱗狀細(xì)胞癌、乳腺癌和胃癌等,并且STOML-2的高表達(dá)與腫瘤細(xì)胞的分化、轉(zhuǎn)移、淋巴結(jié)浸潤(rùn)等密切相關(guān)。最新研究表明,STOML-2在宮頸癌腫瘤組織中也是高表達(dá),其高表達(dá)與腫瘤分期、腫瘤大小和總生存期密切相關(guān),但其確切的調(diào)控機(jī)制仍然不清楚,需要進(jìn)一步的研究。食管鱗狀細(xì)胞癌KYSE450細(xì)胞通過(guò)siRNA轉(zhuǎn)染使STOML-2低表達(dá)后可以抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖以及粘附等生物學(xué)行為。目前的癌癥生物學(xué)研究表明,STOML-2可以通過(guò)調(diào)節(jié)能量代謝和細(xì)胞凋亡來(lái)增強(qiáng)代謝干預(yù)與基因毒性化療藥物的結(jié)合。STOML-2還可以調(diào)節(jié)線粒體鈣離子外流,從而改變線粒體緩沖Ca2+和形成細(xì)胞內(nèi)Ca2+信號(hào)的能力。關(guān)于STOML-2可能的生物學(xué)機(jī)制,有研究稱,其可能參與食管鱗癌細(xì)胞線粒體功能的調(diào)節(jié),從而在改變ATP產(chǎn)量平衡的水平抑制腫瘤細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)和增殖。還有研究表明,上調(diào)STOML-2可能會(huì)大大增加基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP-9)的表達(dá),這與腫瘤細(xì)胞的進(jìn)展緊密相關(guān),如侵襲,遷移,血管生成,和體外癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移等。此外,STOML-2沉默后可以顯著抑制NF-κB的活性和其下游蛋白的表達(dá)水平。STOML-2可以調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的凋亡,但是,其抑制細(xì)胞凋亡的機(jī)制尚不清楚,有待進(jìn)一步研究。實(shí)驗(yàn)方法1.細(xì)胞siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞于轉(zhuǎn)染前一天用不含抗生素的完全培養(yǎng)基接種于6孔培養(yǎng)板,按以下配方稀釋siRNA,預(yù)實(shí)驗(yàn)后可以適當(dāng)調(diào)整siRNA與Iipofectamine2000的用量比；對(duì)于6孔板的每個(gè)孔,將5 u1的siRNA溶液與250 uL Opti-MEM混合：將Lipofectamine2000試劑輕柔搖勻,取5u1在另一管中與250 uL Opti-MEM混合,在室溫下溫育5 min；把稀釋后的siRNA溶液與稀釋后的Lipofectamine 2000進(jìn)行混合,輕輕地顛倒混勻,室溫孵20 min；把siRNA與Lipofectamine2000的混合液加入細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng),根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要收細(xì)胞或后續(xù)處理；RT-PCR和Western blotting檢測(cè)干擾后的抑制效果。篩選轉(zhuǎn)染目標(biāo)干擾序列,選取干擾效率最高的一條siRNA,進(jìn)行轉(zhuǎn)染正式實(shí)驗(yàn)。2.細(xì)胞腺病毒過(guò)表達(dá)細(xì)胞于轉(zhuǎn)染前一天用不含抗生素的完全培養(yǎng)基接種于6孔培養(yǎng)板,2-4×105個(gè)細(xì)胞/ml/孔,轉(zhuǎn)染時(shí),細(xì)胞融合率應(yīng)為40-50%；按照不同的MOI值將腺病毒加入6孔培養(yǎng)板,將6孔培養(yǎng)板放入細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)；在感染細(xì)胞24、48、72小時(shí)分別用熒光顯微鏡觀察細(xì)胞熒光表達(dá)情況。提取感染腺病毒細(xì)胞的全蛋白,用Western blotting檢測(cè)基因過(guò)表達(dá)效果。篩選感染效率合適的MOI值,進(jìn)行過(guò)表達(dá)正式實(shí)驗(yàn)。3.MTT實(shí)驗(yàn)(1)檢測(cè)對(duì)細(xì)胞增殖的影響細(xì)胞經(jīng)過(guò)siRNA轉(zhuǎn)染或者腺病毒過(guò)表達(dá)處理后,將細(xì)胞置于37攝氏度,5%C02的孵箱中培養(yǎng)72小時(shí)；加入配好的MTT溶液20 ul/孔,于37攝氏度,5%C02培養(yǎng)箱避光孵育4小時(shí),棄培養(yǎng)液,每孔加入DMSO溶液150 u1,振蕩10min搖勻,利用酶標(biāo)儀檢測(cè)A490的OD值。(2)檢測(cè)HELA細(xì)胞和SIHA細(xì)胞順鉑的IC50用濃度為0,5,10,15,20,25,30,35,40ug/ml的順鉑處理HELA細(xì)胞,用濃度為0,2.5,5,10,20,30,40,50,60ug/ml的順鉑處理SIHA細(xì)胞,將細(xì)胞置于37攝氏度,5%C02的孵箱中培養(yǎng)24小時(shí)；加入配好的MTT溶液20 ul／孔,于37攝氏度,5% C02培養(yǎng)箱避光孵育4小時(shí),棄培養(yǎng)液,每孔加入DMSO溶液150 ul,振蕩10min搖勻,利用酶標(biāo)儀檢測(cè)A490的OD值。4.細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的細(xì)胞,按照500或1000個(gè)細(xì)胞／孔接種于6孔培養(yǎng)板中,每孔加入細(xì)胞懸液2ml,置于37攝氏度,5%C02培養(yǎng)箱內(nèi)孵育24小時(shí)；按照上述細(xì)胞轉(zhuǎn)染或者腺病毒過(guò)表達(dá)步驟處理細(xì)胞；將細(xì)胞置于37攝氏度,5%CO2的孵箱中培養(yǎng)7天,第4天換液一次；去掉6孔板中的培養(yǎng)基,用冷PBS輕柔的沖洗2次,用4%多聚甲醛固定15分鐘,再用結(jié)晶紫染液染色20分鐘,用流水沖洗干凈,自然晾干,在顯微鏡下計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)大于50個(gè)的細(xì)胞集落的數(shù)目。5.Annexin V-FITC法檢測(cè)STOML-2對(duì)細(xì)胞早期凋亡的影響按照上述細(xì)胞轉(zhuǎn)染步驟處理細(xì)胞,將細(xì)胞置于37攝氏度,5%C02的孵箱中培養(yǎng)48小時(shí)；更換新鮮的完全培養(yǎng)基,同時(shí)加入IC50量的順鉑,將細(xì)胞置于37攝氏度,5%C02的孵箱中培養(yǎng)6小時(shí)；離心收集細(xì)胞,300g,4攝氏度,5分鐘,棄培養(yǎng)基；用冷PBS洗滌細(xì)胞2次,用400ul 1x AnnexinV結(jié)合液懸浮細(xì)胞,濃度大約為1×106cells/ml。在細(xì)胞懸浮液中加入5ul Annexin V-FITC染色液,輕輕混勻后于4攝氏度避光孵育15分鐘。加入10u1 PI染色液后輕輕混勻后于4攝氏度避光孵育5分鐘。經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡比例。6.線粒體內(nèi)鈣離子濃度的檢測(cè)按照上述細(xì)胞轉(zhuǎn)染或者腺病毒過(guò)表達(dá)步驟處理細(xì)胞,將細(xì)胞置于37攝氏度,5%CO2的孵箱中培養(yǎng)48小時(shí)：更換新鮮的完全培養(yǎng)基,同時(shí)加入IC50量的順鉑,將細(xì)胞置于37攝氏度,5%C02的孵箱中培養(yǎng)6小時(shí)；將黑色96孔培養(yǎng)板標(biāo)記為：細(xì)胞樣品孔、空白對(duì)照孔(不含細(xì)胞)、最大對(duì)照孔(不含細(xì)胞)。用染色工作液處理各組細(xì)胞,放入37攝氏度細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育30分鐘,避免光照；即刻放進(jìn)熒光酶標(biāo)儀檢測(cè)：獲得相對(duì)熒光單位(RFU),計(jì)算樣品線粒體內(nèi)鈣離子濃度。7.細(xì)胞凋亡線粒體膜電位的測(cè)定按照上述細(xì)胞轉(zhuǎn)染步驟處理細(xì)胞,將細(xì)胞置于37攝氏度,5%CO2的孵箱中培養(yǎng)48小時(shí)；更換新鮮的完全培養(yǎng)基,同時(shí)加入IC50量的順鉑,將細(xì)胞置于37攝氏度,5%CO2的孵箱中培養(yǎng)6小時(shí)；用JC-1工作液處理各組細(xì)胞,置于37攝氏度,5%C02培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20分鐘;室溫離心2000rpm,5分鐘收集細(xì)胞,用1×Incubation Buffer洗2次；吸取500ul lx Incubation Buffer重新懸浮細(xì)胞,采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。8. RT-PCR按照上述細(xì)胞轉(zhuǎn)染或者腺病毒過(guò)表達(dá)步驟處理細(xì)胞,提取RNA,逆轉(zhuǎn)錄形成cDNA,然后按照95℃30 see 1個(gè)循環(huán)、95℃5sec,60℃34 sec40個(gè)循環(huán)進(jìn)行PCR,用2-△△Ct法進(jìn)行相對(duì)定量分析,計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量。9. Western blotting細(xì)胞經(jīng)過(guò)各種處理后,提起全蛋白或者線粒體蛋白和胞漿蛋白,用恒壓進(jìn)行電泳,電泳結(jié)束后采用恒流的條件進(jìn)行轉(zhuǎn)膜,然后采用5%脫脂奶粉封閉1小時(shí),4攝氏度過(guò)夜孵育一抗,避光孵育二抗1小時(shí),用機(jī)器進(jìn)行曝光,并用quantity one軟件進(jìn)行條帶的定量分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果1. RT-PCR及Western blotting檢測(cè)STOML-2沉默和過(guò)表達(dá)的效果采用siRNA轉(zhuǎn)染HELA和SIHA細(xì)胞以干擾STOML-2基因的表達(dá),RT-PCR及Western blotting的結(jié)果表明,以第2號(hào)siRNA干擾效率最高,在HELA細(xì)胞達(dá)65%,在SIHA細(xì)胞達(dá)到60%。用腺病毒感染HELA和SIHA細(xì)胞使STOML-2基因過(guò)表達(dá),Western blotting的結(jié)果表明,與對(duì)照組相比,當(dāng)MOI=400時(shí),HELA細(xì)胞STOML-2的表達(dá)量達(dá)到200%以上；當(dāng)MOI=50時(shí),SIHA細(xì)胞STOML-2的表達(dá)量達(dá)到300%左右。2. STOML-2對(duì)宮頸癌細(xì)胞增殖的影響用siRNA轉(zhuǎn)染HELA和SIHA細(xì)胞72小時(shí)后,MTT結(jié)果表明,STOML-2沉默后HELA和SIHA細(xì)胞的增殖能力降低,與對(duì)照組相比,分別降低了7%和14%,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(*P0.05,+P0.001)。用腺病毒感染HELA和SIHA細(xì)胞72小時(shí)后,MTT法結(jié)果表明,STOML-2過(guò)表達(dá)后HELA和SIHA細(xì)胞的增殖能力增強(qiáng),與對(duì)照組相比,分別升高了8%和5%,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(*P0.05,+P0.001)。采用細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)再次證明STOML-2對(duì)宮頸癌細(xì)胞增殖的影響,結(jié)果表明,STOML-2沉默后HELA和SIHA細(xì)胞的增殖能力降低,STOML-2過(guò)表達(dá)后HELA和SIHA細(xì)胞的增殖能力增強(qiáng),上述結(jié)果再一次得到了驗(yàn)證。3. STOML-2對(duì)宮頸癌細(xì)胞凋亡的影響首先,采用MTT法計(jì)算出HELA和SIHA細(xì)胞順鉑的IC50,HELA細(xì)胞順鉑的IC50大約是20 ug/ml,而SIHA細(xì)胞順鉑的IC50大約是15ug/ml。其次,用IC50的順鉑作用于STOML-2沉默的HELA和SIHA細(xì)胞6小時(shí),用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。結(jié)果表明,STOML-2沉默后HELA和SIHA細(xì)胞的凋亡增加,并且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(*P0.05,+P0.001)。4. STOML-2對(duì)宮頸癌細(xì)胞線粒體內(nèi)鈣離子濃度的影響用IC50的順鉑作用于STOML-2沉默或過(guò)表達(dá)的HELA和SIHA細(xì)胞6小時(shí),用多功能酶標(biāo)儀進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明,STOML-2沉默后HELA和SIHA細(xì)胞的線粒體內(nèi)鈣離子濃度增加,與對(duì)照組相比,分別增加了230%±13%和192%＋18%;STOML-2過(guò)表達(dá)后HELA和SIHA細(xì)胞的線粒體內(nèi)鈣離子濃度減少,與對(duì)照組相比,分別減少了47%±9%和42%＋9%,并且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(’P0.05,#P0.01)。5. STOML-2對(duì)宮頸癌細(xì)胞線粒體膜電位的影響用IC50的順鉑作用于STOML-2沉默的HELA和SIHA細(xì)胞6小時(shí),用流式細(xì)胞儀分析結(jié)果表明,STOML-2沉默后HELA和SIHA細(xì)胞的線粒體膜電位增加,與對(duì)照組相比,分別為3.8%vs17.9%,3.2%vs25.1%,并且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(*P0.05,+P0.001)。6. STOML-2對(duì)宮頸癌細(xì)胞線粒體凋亡信號(hào)通路相關(guān)蛋白的影響用IC50的順鉑作用于STOML-2沉默或過(guò)表達(dá)的HELA和SIHA細(xì)胞8小時(shí),提取線粒體蛋白和胞漿蛋白進(jìn)行Western blotting實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明,STOML-2沉默后HELA和SIHA細(xì)胞從線粒體釋放到胞漿中的細(xì)胞色素C增加,與對(duì)照組相比,線粒體中的細(xì)胞色素C減少,而胞漿中的細(xì)胞色素C增加；STOML-2過(guò)表達(dá)后HELA和SIHA細(xì)胞從線粒體釋放到胞漿中的細(xì)胞色素C減少,與對(duì)照組相比,線粒體中的細(xì)胞色素C增加,而胞漿中的細(xì)胞色素C減少,并且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(*P0.05,#P0.01,+P0.001)。用IC50的順鉑作用于STOML-2沉默或過(guò)表達(dá)的HELA和SIHA細(xì)胞24小時(shí),提取全蛋白進(jìn)行Western blotting實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明, STOML-2沉默后HELA和SIHA細(xì)胞p-MEK1/2和p-ERK1/2的表達(dá)量減少,而B(niǎo)ax/Bcl-2, cleaved-caspase 3/caspase 3和cleaved-PARP/PARP的比值增加；STOML-2過(guò)表達(dá)后HELA和SIHA細(xì)胞p-MEK1/2和p-ERK1/2的表達(dá)量增加,而B(niǎo)ax/Bcl-2, cleaved-caspase 3/caspase 3和cleaved-PARP/PARP的比值減少,并且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(’P0.05,#P0.01,+P0.001)。7.高濃度的順鉑可以誘導(dǎo)]HELA細(xì)胞中STOML-2基因的高表達(dá)用不同濃度的順鉑(0, 1×IC50,2xIC50,3xIC50,4xIC50,即0,20,40,60,80ug/ml)作用于HELA細(xì)胞8小時(shí),RT-PCR結(jié)果表明,STOML-2的表達(dá)量隨著順鉑濃度的增加而增加。用不同濃度的順鉑(0,1×IC50,2xIC50,3xIC50,4xIC50,即0,20,40,60,80ug/ml)作用于HELA細(xì)胞24小時(shí),Western blotting結(jié)果表明,STOML-2的表達(dá)量隨著順鉑濃度的增加而增加,并且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(*P0.05)。8.高濃度的順鉑對(duì)宮頸癌細(xì)胞線粒體凋亡信號(hào)通路相關(guān)蛋白的影響首先,用不同濃度的順鉑(0,0.5×IC50,1×IC50,1.5×IC50,2×IC50)作用于HELA細(xì)胞和SIHA細(xì)胞8小時(shí),RT-PCR結(jié)果表明,在HELA和SIHA細(xì)胞中,與不加順鉑組相比,1xIC50組中STOML-2的表達(dá)量無(wú)明顯變化；而與1xIC50組相比,2xIC50組中STOML-2的表達(dá)量明顯升高,并且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(#P0.01,+P0.001)。其次,用不同濃度的順鉑(0,0.5×IC50, 1×IC50,1.5×IC50,2×IC50)作用于HELA細(xì)胞和SIHA細(xì)胞24小時(shí),Western blotting結(jié)果表明：①在HELA和SIHA細(xì)胞中,與不加順鉑組相比,1xIC50組中STOML-2的表達(dá)量無(wú)明顯變化；而與1xIC50組相比,2xIC50組中STOML-2的表達(dá)量明顯升高,并且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(’P0.05,+P0.001)。②在HELA和SIHA細(xì)胞中,與1xIC50組相比,2xIC50組中p-MEK1/2和p-ERK1/2的表達(dá)量明顯升高,而B(niǎo)ax/Bcl-2, cleaved-caspase 3/caspase 3和cleaved-PARP/PARP的表達(dá)量的比值明顯降低,并且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(*P0.05,#P0.01,+P0.001)。結(jié)論(1) STOML-2高表達(dá)可以促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的增殖能力；(2) STOML-2高表達(dá)可以抑制宮頸癌細(xì)胞的凋亡；(3)我們的研究結(jié)果首次表明,STOML-2可以通過(guò)激活MEK/ERK信號(hào)通路和抑制線粒體凋亡通路來(lái)抑制宮頸癌細(xì)胞的凋亡；(4)高濃度的順鉑可誘導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞STOML-2的表達(dá)上調(diào)。
【關(guān)鍵詞】：STOML-2 宮頸癌 順鉑 線粒體凋亡通路 MEK/ERK 信號(hào)通路
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R737.33
【目錄】：

• 摘要3-11
• ABSTRACT11-22
• 前言22-27
• 材料與方法27-46
• 一、材料27-30
• 二、實(shí)驗(yàn)方法30-46
• 結(jié)果46-62
• 1. RT-PCR及Western blotting檢測(cè)STOML-2沉默和過(guò)表達(dá)的效果46-48
• 2. STOML-2對(duì)宮頸癌細(xì)胞增殖的影響48-50
• 3. STOML-2對(duì)宮頸癌細(xì)胞凋亡的影響50-52
• 4. STOML-2對(duì)宮頸癌細(xì)胞線粒體內(nèi)鈣離子濃度的影響52-54
• 5. STOML-2對(duì)宮頸癌細(xì)胞線粒體膜電位(MMP)的影響54
• 6. STOML-2對(duì)宮頸癌細(xì)胞線粒體凋亡信號(hào)通路相關(guān)蛋白的影響54-57
• 7. 高濃度的順鉑可以誘導(dǎo)HELA細(xì)胞中STOML-2基因的高表達(dá)57-59
• 8. 高濃度的順鉑對(duì)宮頸癌細(xì)胞線粒體凋亡信號(hào)通路相關(guān)蛋白的影響59-62
• 討論62-66
• 參考文獻(xiàn)66-71
• 攻讀碩士學(xué)位期間成果71-72
• 致謝72-74

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本文編號(hào)：553637