本文關(guān)鍵詞：基于酶反應放大的DNA生物傳感分析及單分子分析

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【摘要】：本文采用了ICP-MS檢測分析方法,制備了修飾有捕獲探針的納米金生物條碼,建立了基于DNA分子機器與酶循環(huán)放大技術(shù)和基于DNA分子信標的特異性識別技術(shù)的方法,實現(xiàn)了對基因等腫瘤標志物的高靈敏,高選擇性檢測：采用了全內(nèi)角反射熒光成像技術(shù),利用滾環(huán)擴增將目標DNA放大增長,將單個目標DNA進行熒光成像,實現(xiàn)了對目標基因的檢測。主要內(nèi)容如下：1.構(gòu)建了一種以ICP-MS檢測技術(shù)為基礎的三聯(lián)放大系統(tǒng),通過剪切鏈置換、滾環(huán)擴增和生物條碼探針,來檢測目標DNA。通過這個方法,乙肝炎病毒的檢測限能達到3.2×10-17M。單錯配堿基的序列也能很好的被分辨。此外,我們能證明該方法能很好的應用于復雜的生物樣品檢測,在生物醫(yī)學領域有著廣闊的前景。2.全內(nèi)反射熒光顯微鏡(total internal reflection fluorescence microscope, TIRF)是一門比較復雜的光學技術(shù),目前已被科學家們廣泛應用,現(xiàn)如今已經(jīng)發(fā)展成為探測細胞-基底接觸區(qū)域內(nèi)細胞生命活動最強有力的方法。將目標DNA滾環(huán)擴增,然后將其產(chǎn)物固定在玻璃板上,運用光鑷將末端修飾有聚苯乙烯微球的稍作移動,這樣做的目的是將PCR擴增的產(chǎn)物在拉力的作用下變?yōu)橐粭l直線,再用與其DNA互補的熒光DNA進行雜交,最后運用TIRF來觀察基底的情況。全內(nèi)反射熒光顯微技術(shù)作為單分子成像的一種新興技術(shù),必將更好的為我們對腫瘤標志物的檢測帶來幫助。
【關(guān)鍵詞】：電感耦合等離子體-質(zhì)譜儀 滾環(huán)放大 全內(nèi)反射熒光顯微鏡 單分子成像 光鑷
【學位授予單位】：青島科技大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R730.4;O657.63
【目錄】：

• 摘要3-4
• ABSTRACT4-10
• 第一章 前言10-41
• 1.1 DNA傳感器10-14
• 1.1.1 DNA的結(jié)構(gòu)特點10-11
• 1.1.2 生物傳感器的工作原理11
• 1.1.3 DNA傳感器的類型11-14
• 1.2 DNA病毒14-17
• 1.2.1 病毒簡介14-15
• 1.2.2 DNA病毒15
• 1.2.3 乙型肝炎病毒15-16
• 1.2.4 乙肝病毒的傳播途徑16-17
• 1.2.5 基因檢測方法17
• 1.3 電感耦合等離子體質(zhì)譜17-21
• 1.3.1 電感耦合等離子體17
• 1.3.2 質(zhì)譜17-18
• 1.3.3 電感耦合等離子體質(zhì)譜18-19
• 1.3.4 ICP-MS的應用19-21
• 1.3.5 展望21
• 1.4 納米金以及在生物傳感器上的應用21-28
• 1.4.1 納米材料21-24
• 1.4.2 納米金24-25
• 1.4.3 納米金的制備簡介25
• 1.4.4 納米金的應用25-28
• 1.5 DNA循環(huán)放大技術(shù)28-30
• 1.5.1 聚合酶鏈反應28
• 1.5.2 滾環(huán)擴增28
• 1.5.3 聚合酶鏈置換反應28-29
• 1.5.4 雜交鏈式反應29
• 1.5.5 鏈取代反應29-30
• 1.6 全內(nèi)反射熒光成像技術(shù)30-32
• 1.6.1 全內(nèi)反射現(xiàn)象31
• 1.6.2 全內(nèi)反射熒光顯微鏡31-32
• 1.7 激光光鑷微操作儀32-34
• 1.8 電泳技術(shù)34-35
• 1.8.1 聚丙烯酰胺凝膠電泳34
• 1.8.2 瓊脂糖凝膠電泳34-35
• 1.9 本工作的意義和研究內(nèi)容35-37
• 參考文獻37-41
• 第二章 基于ICP-MS和酶循環(huán)放大的DNA生物傳感器的研究41-66
• 2.1 引言41-42
• 2.2 實驗部分42-44
• 2.2.1 器材42
• 2.2.2 試劑42-44
• 2.3 實驗準備工作44-46
• 2.3.1 配制0.1M,pH=6.8的咪唑-鹽酸緩沖體系44
• 2.3.2 配制0.01M,ph=5.6醋酸鹽緩沖體系44-45
• 2.3.3 配制0.01M,ph為7.4磷酸鹽緩沖體系45
• 2.3.4 DNA的預處理45-46
• 2.4 實驗步驟46-51
• 2.4.1 DNA在磁珠上的固定46
• 2.4.2 納米金膠的制備46-48
• 2.4.3 生物條碼的制備48-49
• 2.4.4 探針的捕獲和剪切聚合49
• 2.4.5 滾環(huán)擴增反應49-50
• 2.4.6 將信號引入分子機器50
• 2.4.7 ICP-MS檢測50-51
• 2.5 結(jié)果與討論51-61
• 2.5.1 基于ICP-MS和酶循環(huán)放大技術(shù)的DNA生物傳感器的原理51-52
• 2.5.2 納米金粒子的表征52-54
• 2.5.3 納米金生物條碼的紫外表征54
• 2.5.4 可行性實驗54-56
• 2.5.5 實驗條件的優(yōu)化56-59
• 2.5.6 靶DNA的檢測59
• 2.5.7 對照實驗59-60
• 2.5.8 對目標DNA的選擇性測試60-61
• 2.5.9 DNA分子機器ICP-MS檢測生物樣品61
• 2.6 小結(jié)61-63
• 參考文獻63-66
• 第三章 基于全內(nèi)反射熒光成像及光鑷的單分子分析66-81
• 3.1 引言66-67
• 3.2 實驗部分67-68
• 3.2.1 儀器67
• 3.2.2 試劑67-68
• 3.3 實驗的準備工作68-69
• 3.3.1 配制25mM 的 Tris-OAc (50mM NaCl) PH=7.5 的緩沖體系68-69
• 3.3.2 配制0.05M, ph為7.5磷酸鹽緩沖體系（PBS）69
• 3.3.3 DNA的預處理69
• 3.4 實驗步驟69-72
• 3.4.1 氨基化玻璃片的制備69-70
• 3.4.2 氨基化玻璃片的醛基活化70
• 3.4.3 探針的固定70
• 3.4.4 滾環(huán)擴增70
• 3.4.5 末端轉(zhuǎn)移反應70-71
• 3.4.6 激光光鑷微操作71
• 3.4.7 全內(nèi)反射熒光檢測71-72
• 3.5 結(jié)果與討論72-78
• 3.5.1 實驗原理72-73
• 3.5.2 捕獲探針濃度的選擇73
• 3.5.3 滾環(huán)方式的選擇73-75
• 3.5.4 滾環(huán)并光鑷微操作75-76
• 3.5.5 聚合替換76
• 3.5.6 嵌插染料76-77
• 3.5.7 剪碎長鏈77-78
• 3.6. 小結(jié)78-79
• 參考文獻79-81
• 結(jié)論81-82
• 致謝82-83
• 攻讀碩士學位期間發(fā)表的學術(shù)論文目錄83-84

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