本文關(guān)鍵詞：丙戊酸致乳腺癌細(xì)胞放射增敏作用及其同源重組修復(fù)的分子機(jī)制研究

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【摘要】：目的乳腺癌是全球女性最常見的惡性腫瘤疾病之一,并嚴(yán)重威脅到女性的身心健康。由此,乳腺癌的治療,特別是對(duì)乳腺癌的放射治療問(wèn)題一直備受全世界學(xué)者關(guān)注,如何增強(qiáng)乳腺癌細(xì)胞對(duì)放射的敏感性更是該領(lǐng)域?qū)W者們關(guān)注的焦點(diǎn)問(wèn)題。丙戊酸(Valproic Acid, VPA)是一種含有8個(gè)碳原子的短鏈脂肪酸類的組蛋白去乙酰化酶抑制劑(histone deacetylase inhibitors, HDACis),它通過(guò)抑制組蛋白去乙�；傅幕钚�,進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞組蛋白高度乙酰化。臨床上VPA主要用于癲癇患者的治療,目前發(fā)現(xiàn)VPA不但對(duì)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)具有抑制作用,還發(fā)現(xiàn)高濃度的VPA(如5mmol/L)可以增加乳腺癌細(xì)胞對(duì)放射的敏感性,提示VPA在乳腺癌放療中可能是一個(gè)潛在的放射增敏劑,深入研究還揭示VPA放射增敏作用的一個(gè)可能機(jī)制是破壞了DNA損傷修復(fù)機(jī)制。但VPA在臨床安全劑量范圍內(nèi)的放射增敏作用及其分子機(jī)制卻不十分清楚。根據(jù)VPA治療癲癇病的安全血藥劑量為0.3-0.8mmol/L,本課題選擇臨床安全劑量0.5mmol/L和臨界安全劑量1mmol/L的VPA,研究其對(duì)乳腺癌細(xì)胞MCF7放射敏感性的影響；同時(shí),同源重組(Homologous Recombination, HR)是DNA雙鏈斷鏈修復(fù)的一個(gè)重要機(jī)制,本課題還探討了VPA誘導(dǎo)的放射增敏作用中對(duì)HR修復(fù)的分子機(jī)制影響,目的在于為VPA用于臨床上治療乳腺癌患者提供可靠的理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法1.DNA雙鏈斷裂標(biāo)志物γ-H2AX及HR修復(fù)關(guān)鍵蛋白R(shí)ad51和BRCA1表達(dá)的檢測(cè)用VPA臨床安全劑量0.5 mmol/L和臨界安全劑量1 mmol/L分別預(yù)處理MCF7細(xì)胞24,48和72h后,給予8Gy電離輻射后恢復(fù)6h,用蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)觀察γ-H2AX、Rad51和BRCA1蛋白表達(dá),用免疫熒光方法觀察γ-H2AX、Rad51和BRCA1蛋白焦點(diǎn)形成情況。2.MTT和克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)VPA對(duì)MCF7細(xì)胞放射敏感性的變化取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MCF7細(xì)胞,用VPA 0.5和1 mmol/L分別預(yù)處理細(xì)胞72h,然后給予4Gy電離輻射后48h,用MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率；MCF7細(xì)胞用VPA 0.5 mmol/L預(yù)處理24h后,根據(jù)每皿接種不同的細(xì)胞數(shù)目分別給予不同劑量的電離輻射照射：2Gy(500個(gè)/皿1000個(gè)/皿)、4Gy(2000個(gè)/皿和4000個(gè)/皿)、6Gy(8000個(gè)/皿和16000個(gè)/皿),計(jì)數(shù)克隆形成數(shù)量并計(jì)算克隆形成率。3.HR修復(fù)效率的檢測(cè)向帶有表達(dá)重組底物pDR-GFP的MCF7細(xì)胞中轉(zhuǎn)染IsceI質(zhì)粒4h后,分別用VPA 0.5和1 mmol/L處理MCF7細(xì)胞24h,收集細(xì)胞后,用流式細(xì)胞儀測(cè)定HR效率。4.細(xì)胞周期的檢測(cè)用VPA 0.5和1 mmol/L分別預(yù)處理MCF7細(xì)胞24,48和72h后,收集細(xì)胞,用冰乙醇固定,流式細(xì)胞儀檢測(cè)前用PI染液進(jìn)行染色。結(jié)果1.應(yīng)答DNA損傷反應(yīng)時(shí),VPA對(duì)DNA雙鏈斷裂標(biāo)志物γ-H2AX的影響蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,VPA 0.5和1 mmol/L處理后,與正常對(duì)照組相比,γ-H2AX表達(dá)量均呈增加趨勢(shì)；VPA預(yù)處理后再給予8Gy電離輻射處理,與單獨(dú)電離輻射組相比,γ-H2AX表達(dá)量增加更加明顯。免疫熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,VPA單獨(dú)作用于MCF7細(xì)胞后,就能導(dǎo)致細(xì)胞核內(nèi)γ-H2AX焦點(diǎn)數(shù)顯著增加,并隨著作用時(shí)間延長(zhǎng),焦點(diǎn)數(shù)目呈逐漸增加的趨勢(shì)。其中,VPA 0.5 mmol/L分別處理MCF7細(xì)胞24,48和72h后,與對(duì)照組γ-H2AX焦點(diǎn)形成陽(yáng)性率(指10焦點(diǎn)/細(xì)胞,為5.51%)相比,分別又增加了5.30%(P0.05),7.11%(P0.01)和12.24%(P0.01); VPA 1 mmol/L分別處理MCF7細(xì)胞24,48和72h后,與對(duì)照組相比γ-H2AX焦點(diǎn)陽(yáng)性率變化與0.5 mmol/L處理組有相同趨勢(shì),也分別增加了9.33%(P0.05),13.91%(P0.01)和17.38%(P0.01)。VPA預(yù)處理MCF7細(xì)胞不同時(shí)間后分別給予8Gy電離輻射,恢復(fù)6h時(shí)發(fā)現(xiàn)所有細(xì)胞都有γ-H2AX焦點(diǎn)形成的表現(xiàn),但根據(jù)細(xì)胞內(nèi)γ-H2AX焦點(diǎn)形態(tài)將其分為兩類：A類細(xì)胞(細(xì)胞含焦點(diǎn)相對(duì)較小且較暗的細(xì)胞,代表DNA損傷相對(duì)較輕)和B類細(xì)胞(細(xì)胞含焦點(diǎn)相對(duì)較大且明亮的細(xì)胞,代表DNA損傷相對(duì)較重)。單獨(dú)電離輻射處理時(shí)γ-H2AX焦點(diǎn)的形態(tài)主要以A類細(xì)胞為主,然而給予VPA預(yù)處理24h時(shí)就觀察到代表?yè)p傷較重的B類細(xì)胞所占比例明顯增加,隨預(yù)處理時(shí)間延長(zhǎng),其比例進(jìn)一步顯著增加,呈時(shí)間依賴性。其中,VPA 0.5 mmol/L分別預(yù)處理MCF7細(xì)胞24,48和72h后,與單獨(dú)照射組B類細(xì)胞所占比例(16.51%)相比,分別增加了12.43%(P0.05),41.46%(P0.01)和54.25%(P0.01); VPA 1 mmol/L分別預(yù)處理MCF7細(xì)胞24,48和72h后,與單獨(dú)照射組相比B類細(xì)胞所占比例的變化與0.5 mmol/L處理組有相同趨勢(shì),也分別增加了31.75%(P0.05),51.19%(P0.01)和54.92%(P0.01)。2.VPA增強(qiáng)MCF7細(xì)胞對(duì)放射的敏感性MTT與細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果均顯示,VPA 0.5和1 mmol/L單獨(dú)作用于MCF7細(xì)胞后,與正常對(duì)照組相比均可顯著降低細(xì)胞克隆形成率(P0.05)。與單獨(dú)照射處理組相比,VPA 0.5mmol/L預(yù)處理MCF7細(xì)胞后接受電離輻射能顯著降低細(xì)胞細(xì)胞克隆形成率和細(xì)胞存活率(P0.05)；3.VPA導(dǎo)致MCF7細(xì)胞HR修復(fù)功能障礙與正常對(duì)照組相比,VPA處理組HR效率明顯降低：VPA 0.5和1 mmol/L處理MCF7細(xì)胞24h后與對(duì)照組相比,HR效率分別降低42.59%(P0.01)和37.58%(P0.01)。4.VPA通過(guò)降低BRCAl和Rad51的表達(dá)抑制HR修復(fù)過(guò)程蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,VPA 0.5和1 mmol/L處理MCF7細(xì)胞24h后,BRCA1蛋白表達(dá)量與對(duì)照組相比呈降低趨勢(shì)；VPA 0.5和1 mmol/L預(yù)處理MCF7細(xì)胞24h后再給予8Gy電離輻射處理,Rad51和BRCA1蛋白表達(dá)量與單獨(dú)電離輻射組相比,降低更加明顯。免疫熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,VPA lmmol/L單獨(dú)處理MCF7細(xì)胞24h后,與對(duì)照組細(xì)胞核內(nèi)Rad51焦點(diǎn)形成陽(yáng)性率(指10焦點(diǎn)/細(xì)胞,為4.33%)相比,又降低了2.03%(P0.05); VPA 0.5和1 mmol/L預(yù)處理MCF7細(xì)胞24h再給予8Gy電離輻射后,與單獨(dú)電離輻射組的Rad51焦點(diǎn)形成陽(yáng)性率(12.55%)相比降低更加明顯,分別降低了6.64%(P0.05)和6.59%(P0.05)。VPA 0.5和1 mmol/L單獨(dú)處理MCF7細(xì)胞72h后,與對(duì)照組的細(xì)胞核內(nèi)BRCA1焦點(diǎn)形成陽(yáng)性率(指10焦點(diǎn)/細(xì)胞,為5.13%)相比,分別降低了4.1%(P0.05)和3.84%(P0.05)；VPA預(yù)處理MCF7細(xì)胞24,48和72h后再給予8Gy電離輻射,恢復(fù)6h時(shí)發(fā)現(xiàn)與單獨(dú)電離輻射組的BRCA1焦點(diǎn)形成陽(yáng)性率(38.45%)相比,呈時(shí)間依賴性降低,其中VPA 0.5 mmol/L預(yù)處理組分別降低了3.48%(P0.05),23.57%(P0.01)和29.22%(P0.01); VPA 1 mmol/L預(yù)處理組焦點(diǎn)形成陽(yáng)性率變化有相同趨勢(shì),分別降低了12.71%(P0.05),24.73%(P0.01)和30.83%(P0.01)。5.安全和臨界劑量VPA對(duì)MCF7細(xì)胞周期的影響VPA 0.5和1 mmol/L作用于MCF7細(xì)胞后,細(xì)胞周期的各時(shí)相均未發(fā)生顯著性變化。結(jié)論本課題發(fā)現(xiàn)臨床安全劑量和臨界安全劑量的VPA對(duì)乳腺癌細(xì)胞MCF7具有如下作用：1.應(yīng)答DNA損傷反應(yīng)時(shí), VPA能引起MCF7細(xì)胞核內(nèi)DNA雙鏈斷裂損傷的蓄積。2.VPA不僅對(duì)乳腺癌細(xì)胞MCF7生長(zhǎng)具有抑制作用,還能增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)放射的敏感性。3.VPA對(duì)MCF7的細(xì)胞周期未產(chǎn)生影響。4.VPA可能通過(guò)抑制重組蛋白BRCA1和Rad51的活性造成HR修復(fù)機(jī)制的損害。由于MCF7是細(xì)胞凋亡相關(guān)的胱天蛋白酶3基因缺失的細(xì)胞,再加上在本課題研究條件下VPA對(duì)細(xì)胞周期無(wú)影響,結(jié)果還提示BRCA1-Rad51介導(dǎo)的HR.分子機(jī)制的破壞是VPA致乳腺癌放射敏感性增強(qiáng)的關(guān)鍵機(jī)制。
【關(guān)鍵詞】：乳腺癌細(xì)胞 丙戊酸 放射增敏 同源重組 BRCA1 Rad51
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R737.9
【目錄】：

• 中文摘要6-10
• 英文摘要10-15
• 符號(hào)說(shuō)明15-16
• 前言16-24
• 材料與方法24-37
• 實(shí)驗(yàn)結(jié)果37-47
• 討論47-55
• 結(jié)論55-56
• 參考文獻(xiàn)56-63
• 致謝63-64
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的論文64-65
• 附件65

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 牛俊婕;王晗;徐英;周勇;姜玉華;;丙戊酸鈉增強(qiáng)大鼠膠質(zhì)瘤C6細(xì)胞放射敏感性的體外實(shí)驗(yàn)[J];山東大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版);2013年06期

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本文編號(hào)：549166