本文關鍵詞：丙戊酸致乳腺癌細胞放射增敏作用及其同源重組修復的分子機制研究

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【摘要】：目的乳腺癌是全球女性最常見的惡性腫瘤疾病之一,并嚴重威脅到女性的身心健康。由此,乳腺癌的治療,特別是對乳腺癌的放射治療問題一直備受全世界學者關注,如何增強乳腺癌細胞對放射的敏感性更是該領域?qū)W者們關注的焦點問題。丙戊酸(Valproic Acid, VPA)是一種含有8個碳原子的短鏈脂肪酸類的組蛋白去乙�；敢种苿�(histone deacetylase inhibitors, HDACis),它通過抑制組蛋白去乙酰化酶的活性,進而導致細胞組蛋白高度乙�；ＥR床上VPA主要用于癲癇患者的治療,目前發(fā)現(xiàn)VPA不但對腫瘤細胞的生長具有抑制作用,還發(fā)現(xiàn)高濃度的VPA(如5mmol/L)可以增加乳腺癌細胞對放射的敏感性,提示VPA在乳腺癌放療中可能是一個潛在的放射增敏劑,深入研究還揭示VPA放射增敏作用的一個可能機制是破壞了DNA損傷修復機制。但VPA在臨床安全劑量范圍內(nèi)的放射增敏作用及其分子機制卻不十分清楚。根據(jù)VPA治療癲癇病的安全血藥劑量為0.3-0.8mmol/L,本課題選擇臨床安全劑量0.5mmol/L和臨界安全劑量1mmol/L的VPA,研究其對乳腺癌細胞MCF7放射敏感性的影響；同時,同源重組(Homologous Recombination, HR)是DNA雙鏈斷鏈修復的一個重要機制,本課題還探討了VPA誘導的放射增敏作用中對HR修復的分子機制影響,目的在于為VPA用于臨床上治療乳腺癌患者提供可靠的理論和實驗依據(jù)。方法1.DNA雙鏈斷裂標志物γ-H2AX及HR修復關鍵蛋白Rad51和BRCA1表達的檢測用VPA臨床安全劑量0.5 mmol/L和臨界安全劑量1 mmol/L分別預處理MCF7細胞24,48和72h后,給予8Gy電離輻射后恢復6h,用蛋白質(zhì)免疫印跡實驗觀察γ-H2AX、Rad51和BRCA1蛋白表達,用免疫熒光方法觀察γ-H2AX、Rad51和BRCA1蛋白焦點形成情況。2.MTT和克隆形成實驗檢測VPA對MCF7細胞放射敏感性的變化取處于對數(shù)生長期的MCF7細胞,用VPA 0.5和1 mmol/L分別預處理細胞72h,然后給予4Gy電離輻射后48h,用MTT法檢測細胞存活率；MCF7細胞用VPA 0.5 mmol/L預處理24h后,根據(jù)每皿接種不同的細胞數(shù)目分別給予不同劑量的電離輻射照射：2Gy(500個/皿1000個/皿)、4Gy(2000個/皿和4000個/皿)、6Gy(8000個/皿和16000個/皿),計數(shù)克隆形成數(shù)量并計算克隆形成率。3.HR修復效率的檢測向帶有表達重組底物pDR-GFP的MCF7細胞中轉(zhuǎn)染IsceI質(zhì)粒4h后,分別用VPA 0.5和1 mmol/L處理MCF7細胞24h,收集細胞后,用流式細胞儀測定HR效率。4.細胞周期的檢測用VPA 0.5和1 mmol/L分別預處理MCF7細胞24,48和72h后,收集細胞,用冰乙醇固定,流式細胞儀檢測前用PI染液進行染色。結果1.應答DNA損傷反應時,VPA對DNA雙鏈斷裂標志物γ-H2AX的影響蛋白質(zhì)免疫印跡實驗結果顯示,VPA 0.5和1 mmol/L處理后,與正常對照組相比,γ-H2AX表達量均呈增加趨勢；VPA預處理后再給予8Gy電離輻射處理,與單獨電離輻射組相比,γ-H2AX表達量增加更加明顯。免疫熒光實驗結果顯示,VPA單獨作用于MCF7細胞后,就能導致細胞核內(nèi)γ-H2AX焦點數(shù)顯著增加,并隨著作用時間延長,焦點數(shù)目呈逐漸增加的趨勢。其中,VPA 0.5 mmol/L分別處理MCF7細胞24,48和72h后,與對照組γ-H2AX焦點形成陽性率(指10焦點/細胞,為5.51%)相比,分別又增加了5.30%(P0.05),7.11%(P0.01)和12.24%(P0.01); VPA 1 mmol/L分別處理MCF7細胞24,48和72h后,與對照組相比γ-H2AX焦點陽性率變化與0.5 mmol/L處理組有相同趨勢,也分別增加了9.33%(P0.05),13.91%(P0.01)和17.38%(P0.01)。VPA預處理MCF7細胞不同時間后分別給予8Gy電離輻射,恢復6h時發(fā)現(xiàn)所有細胞都有γ-H2AX焦點形成的表現(xiàn),但根據(jù)細胞內(nèi)γ-H2AX焦點形態(tài)將其分為兩類：A類細胞(細胞含焦點相對較小且較暗的細胞,代表DNA損傷相對較輕)和B類細胞(細胞含焦點相對較大且明亮的細胞,代表DNA損傷相對較重)。單獨電離輻射處理時γ-H2AX焦點的形態(tài)主要以A類細胞為主,然而給予VPA預處理24h時就觀察到代表損傷較重的B類細胞所占比例明顯增加,隨預處理時間延長,其比例進一步顯著增加,呈時間依賴性。其中,VPA 0.5 mmol/L分別預處理MCF7細胞24,48和72h后,與單獨照射組B類細胞所占比例(16.51%)相比,分別增加了12.43%(P0.05),41.46%(P0.01)和54.25%(P0.01); VPA 1 mmol/L分別預處理MCF7細胞24,48和72h后,與單獨照射組相比B類細胞所占比例的變化與0.5 mmol/L處理組有相同趨勢,也分別增加了31.75%(P0.05),51.19%(P0.01)和54.92%(P0.01)。2.VPA增強MCF7細胞對放射的敏感性MTT與細胞克隆形成實驗結果均顯示,VPA 0.5和1 mmol/L單獨作用于MCF7細胞后,與正常對照組相比均可顯著降低細胞克隆形成率(P0.05)。與單獨照射處理組相比,VPA 0.5mmol/L預處理MCF7細胞后接受電離輻射能顯著降低細胞細胞克隆形成率和細胞存活率(P0.05)；3.VPA導致MCF7細胞HR修復功能障礙與正常對照組相比,VPA處理組HR效率明顯降低：VPA 0.5和1 mmol/L處理MCF7細胞24h后與對照組相比,HR效率分別降低42.59%(P0.01)和37.58%(P0.01)。4.VPA通過降低BRCAl和Rad51的表達抑制HR修復過程蛋白質(zhì)免疫印跡實驗結果顯示,VPA 0.5和1 mmol/L處理MCF7細胞24h后,BRCA1蛋白表達量與對照組相比呈降低趨勢；VPA 0.5和1 mmol/L預處理MCF7細胞24h后再給予8Gy電離輻射處理,Rad51和BRCA1蛋白表達量與單獨電離輻射組相比,降低更加明顯。免疫熒光實驗結果顯示,VPA lmmol/L單獨處理MCF7細胞24h后,與對照組細胞核內(nèi)Rad51焦點形成陽性率(指10焦點/細胞,為4.33%)相比,又降低了2.03%(P0.05); VPA 0.5和1 mmol/L預處理MCF7細胞24h再給予8Gy電離輻射后,與單獨電離輻射組的Rad51焦點形成陽性率(12.55%)相比降低更加明顯,分別降低了6.64%(P0.05)和6.59%(P0.05)。VPA 0.5和1 mmol/L單獨處理MCF7細胞72h后,與對照組的細胞核內(nèi)BRCA1焦點形成陽性率(指10焦點/細胞,為5.13%)相比,分別降低了4.1%(P0.05)和3.84%(P0.05)；VPA預處理MCF7細胞24,48和72h后再給予8Gy電離輻射,恢復6h時發(fā)現(xiàn)與單獨電離輻射組的BRCA1焦點形成陽性率(38.45%)相比,呈時間依賴性降低,其中VPA 0.5 mmol/L預處理組分別降低了3.48%(P0.05),23.57%(P0.01)和29.22%(P0.01); VPA 1 mmol/L預處理組焦點形成陽性率變化有相同趨勢,分別降低了12.71%(P0.05),24.73%(P0.01)和30.83%(P0.01)。5.安全和臨界劑量VPA對MCF7細胞周期的影響VPA 0.5和1 mmol/L作用于MCF7細胞后,細胞周期的各時相均未發(fā)生顯著性變化。結論本課題發(fā)現(xiàn)臨床安全劑量和臨界安全劑量的VPA對乳腺癌細胞MCF7具有如下作用：1.應答DNA損傷反應時, VPA能引起MCF7細胞核內(nèi)DNA雙鏈斷裂損傷的蓄積。2.VPA不僅對乳腺癌細胞MCF7生長具有抑制作用,還能增強細胞對放射的敏感性。3.VPA對MCF7的細胞周期未產(chǎn)生影響。4.VPA可能通過抑制重組蛋白BRCA1和Rad51的活性造成HR修復機制的損害。由于MCF7是細胞凋亡相關的胱天蛋白酶3基因缺失的細胞,再加上在本課題研究條件下VPA對細胞周期無影響,結果還提示BRCA1-Rad51介導的HR.分子機制的破壞是VPA致乳腺癌放射敏感性增強的關鍵機制。
【關鍵詞】：乳腺癌細胞 丙戊酸 放射增敏 同源重組 BRCA1 Rad51
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R737.9
【目錄】：

• 中文摘要6-10
• 英文摘要10-15
• 符號說明15-16
• 前言16-24
• 材料與方法24-37
• 實驗結果37-47
• 討論47-55
• 結論55-56
• 參考文獻56-63
• 致謝63-64
• 攻讀學位期間發(fā)表的論文64-65
• 附件65

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 牛俊婕;王晗;徐英;周勇;姜玉華;;丙戊酸鈉增強大鼠膠質(zhì)瘤C6細胞放射敏感性的體外實驗[J];山東大學學報(醫(yī)學版);2013年06期

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本文編號：549166