本文關(guān)鍵詞：MicroRNA-21靶向Fas Ligand抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的凋亡和對5-FU的化學(xué)敏感性

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【摘要】：結(jié)腸癌是全球死亡率第三高的惡性腫瘤。有研究表明miRNA及其相關(guān)靶基因都與腫瘤細(xì)胞耐藥性增加和細(xì)胞凋亡有關(guān)。本文揭示miR-21及其靶基因FasL在結(jié)腸癌細(xì)胞發(fā)展過程中的關(guān)系。本實驗主要通過軟件TargetScan, PicTar, microRNA.org 和 miRecords 及 q-RT-PCR預(yù)測miR-21的靶基因,雙熒光素酶報告系統(tǒng)確定FasL為miR-21的直接靶基因。Pre-miR-21, siFasL和對照NC分別轉(zhuǎn)染進(jìn)RKO-WT細(xì)胞,通過CCK-8檢測細(xì)胞活性,同時通過q-RT-PCR和Western Blotting檢測FasL的表達(dá)及caspase-3和裂解caspase-3的蛋白表達(dá)水平,得到以下結(jié)果：1.結(jié)腸癌RKO細(xì)胞中,FasL為miR-21的直接靶基因；2.MiR-21通過靶向FasL的3’UTR區(qū)抑制其在：nRNA和蛋白水平的表達(dá)；3.外源的pre-miR-21前體轉(zhuǎn)染進(jìn)RKO-WT細(xì)胞,使miR-21過表達(dá),明顯抑制FasL的表達(dá),促進(jìn)細(xì)胞增殖,抑制細(xì)胞凋亡；4.外源的siFasL轉(zhuǎn)染進(jìn)RKO-WT細(xì)胞,使FasL表達(dá)被抑制,會促進(jìn)細(xì)胞增殖,抑制細(xì)胞凋亡；5.5-FU處理RKO細(xì)胞48小時,促使FasL在RNA和蛋白水平高表達(dá)；6.miR-21抑制FasL的表達(dá),增加結(jié)腸癌RKO細(xì)胞對5-FU的化學(xué)耐藥性,細(xì)胞凋亡水平降低,裂解的caspase-3蛋白表達(dá)水平降低。以上結(jié)果表明,miR-21通過靶向FasL的3’UTR區(qū)抑制FasL在mRNA和蛋白水平的表達(dá),從而抑制FasL所參與的信號通路,使結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡水平下降,增加結(jié)腸癌RKO細(xì)胞對5-FU的化學(xué)耐藥性。而過表達(dá)miR-21或者敲低FasL的表達(dá)均會降低細(xì)胞凋亡水平,降低RKO細(xì)胞對5-FU的敏感性,說明miR-21和FasL都可能成為臨床治療結(jié)腸癌的靶點。
【關(guān)鍵詞】：miR-21 FasL 五氟尿嘧啶 結(jié)腸癌
【學(xué)位授予單位】：西南交通大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R735.35
【目錄】：

• 摘要6-7
• Abstract7-11
• 第1章 緒論11-21
• 1.1 研究背景11-18
• 1.1.1 MicroRNA的研究進(jìn)展11-15
• 1.1.2 MiRNA-21在腫瘤細(xì)胞中的作用15-16
• 1.1.3 五氟尿嘧啶(5-FU)的作用機制16-18
• 1.1.4 FasL的作用機制18
• 1.2 課題研究的意義及技術(shù)路線18-21
• 1.2.1 課題研究的意義18-19
• 1.2.2 課題研究內(nèi)容及技術(shù)路線19-21
• 第2章 MiR-21靶基因的預(yù)測及功能富集分析21-28
• 2.1 引言21
• 2.2 實驗材料21
• 2.3 實驗方法21-22
• 2.4 實驗結(jié)果22-27
• 2.4.1 保守的miR-21序列22-23
• 2.4.2 預(yù)測miR-21的靶基因23-24
• 2.4.3 miR-21靶基因的功能注釋分析24-26
• 2.4.4 MiR-21靶基因的KEGG通路分析26-27
• 2.4.5 確定實驗用miR-21靶基因27
• 2.5 本章小結(jié)27-28
• 第3章 MiR-21靶向FasL抑制結(jié)腸癌細(xì)胞對5-FU的化學(xué)敏感性28-52
• 3.1 實驗材料28-31
• 3.1.1 實驗細(xì)胞28
• 3.1.2 實驗試劑28-29
• 3.1.3 實驗設(shè)備29
• 3.1.4 引物、siRNA及miRNA mimics合成29-31
• 3.2 試驗方法31-43
• 3.2.1 結(jié)腸癌RKO細(xì)胞培養(yǎng)31-33
• 3.2.2 總RNA提取和反轉(zhuǎn)錄33-34
• 3.2.3 實時定量PCR34-35
• 3.2.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染35-36
• 3.2.5 載體構(gòu)建36-40
• 3.2.6 細(xì)胞活性檢測40
• 3.2.7 Western blotting40-42
• 3.2.8 統(tǒng)計學(xué)分析42-43
• 3.3 實驗結(jié)果43-51
• 3.3.1 miR-21潛在靶基因的確定43
• 3.3.2 最可能的潛在的miR-21的靶基因的篩選43-47
• 3.3.3 確定FasL是miR-21的直接靶基因47-48
• 3.3.4 過表達(dá)miR-21和干擾FasL表達(dá)影響結(jié)腸癌細(xì)胞對5-FU耐藥性48-49
• 3.3.5 miR-21靶向FasL降低5-FU誘導(dǎo)的結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡49-51
• 3.4 本章小結(jié)51-52
• 討論52-56
• 結(jié)論56-58
• 致謝58-59
• 參考文獻(xiàn)59-66
• 附錄66-67
• 攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的論文和科研成果67

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本文編號：540045