本文關(guān)鍵詞：銀杏葉提取物對(duì)小鼠黑素瘤B16細(xì)胞的增殖和凋亡的影響

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【摘要】：目的:近年來由于中藥研究的不斷發(fā)展,銀杏受到多數(shù)研究學(xué)者的重視,并對(duì)其葉、花、果及外種皮等進(jìn)行了不同程度的藥理學(xué)研究,其對(duì)銀杏葉提取物(ginkgobiloba extract,EGB)研究頗為深入。EGB是一種標(biāo)準(zhǔn)的銀杏葉提取物,含24%的黃酮(主要是橡黃素、山萘酚和異鼠李素)和6%的內(nèi)酯(含2.8%~3.4%銀杏三內(nèi)酯和2.6%~3.2%銀杏新內(nèi)酯),它們是EGB中最重要的活性物質(zhì),其他的組分還包括原花青素、葡萄糖、鼠李糖、有機(jī)酸、D-糖質(zhì)酸和白果酸。目前,EGB制劑已作為一種治療藥物廣泛應(yīng)用于一些心血管和神經(jīng)性功能障礙的疾病。近年來,很多研究證明EGB有一定的抗腫瘤作用,還有放射增敏效果,同時(shí),并不增加正常組織的急性放射性損傷,但EGB抗黑色素瘤的研究鮮有報(bào)告,且作用機(jī)制尚不清楚。惡性黑素瘤(malignant melanoma,MM)是一種高度惡性的腫瘤,多發(fā)生于皮膚,國(guó)外統(tǒng)計(jì)占所有惡性腫瘤的1%~2%,在癌癥死亡病例中,MM約占1%。且發(fā)病率有逐年上升的趨勢(shì)。其轉(zhuǎn)移早而廣泛,而且對(duì)手術(shù)、放化療效果欠佳,且副作用大,是一種臨床治療上頗為棘手的惡性腫瘤。有研究發(fā)現(xiàn),EGB抑制腫瘤增殖及誘導(dǎo)凋亡,降低腫瘤細(xì)胞的表面標(biāo)記物;能上調(diào)P53m RNA基因的表達(dá)、下調(diào)Bcl-2m RNA基因表達(dá)及提高Caspase-3的活性,阻滯腫瘤細(xì)胞進(jìn)入分裂期,促進(jìn)細(xì)胞凋亡。因此,EGB抗腫瘤的活性的機(jī)制便成為人們研究的熱點(diǎn)之一,但EGB對(duì)惡性黑素瘤B16細(xì)胞的作用目前尚未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過EGB對(duì)小鼠黑素瘤B16細(xì)胞的增殖、凋亡及Caspase-3的影響,來分析其對(duì)黑素瘤細(xì)胞的作用機(jī)理,為銀杏葉提取物誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的基礎(chǔ)研究及臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法:1細(xì)胞培養(yǎng)將小鼠黑色素瘤B16細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI-1640(不含雙抗)培養(yǎng)基中,放置于37℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行常規(guī)傳代培養(yǎng)。2該實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組(藥物濃度為0mg/L)及不同濃度銀杏葉提取物(EGB)濃度藥物組,應(yīng)用MTT法檢測(cè)B16細(xì)胞加不同濃度的銀杏葉提取物(20 mg/L、40 mg/L、80 mg/L、160 mg/L、320 mg/L)繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)后,藥物對(duì)細(xì)胞增殖活力的影響,計(jì)算相應(yīng)濃度抑制率及IC50。3倒置顯微鏡觀察不同濃度EGB處理前及處理48小時(shí)后對(duì)B16細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察并拍照。4采用PI染色法用流式細(xì)胞儀對(duì)B16細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞周期分析。5采用Annexin V/PI染色法用流式細(xì)胞儀對(duì)B16細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞凋亡分析。6采用免疫印跡法檢測(cè)活性Caspase-3蛋白在B16細(xì)胞中的表達(dá)情況。7應(yīng)用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS13.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析及處理,以P0.05為差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果:1藥物作用前的B16細(xì)胞呈多角形或菱形,貼壁生長(zhǎng),大小一致,均勻分布,增殖旺盛,未見固縮現(xiàn)象(Fig.1)。2 MTT結(jié)果顯示,EGB對(duì)小鼠黑素瘤B16細(xì)胞具有增殖抑制作用,實(shí)驗(yàn)組(EGB濃度為20、40、80、160、320mg/L),培養(yǎng)48h后,OD值分別為0.615±0.026、0.537±0.029、0.414±0.016、0.386±0.012、0.347±0.037;而對(duì)照組(EGB為0mg/L)OD值為0.839±0.034,實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組比較,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);相對(duì)抑制率(%):25.18、34.67、50.65、53.99、58.64(Table 1,Fig.3),統(tǒng)計(jì)學(xué)Logit法計(jì)算IC50為87.65mg/L。3 EGB對(duì)小鼠B16細(xì)胞的細(xì)胞分化及形態(tài)的影響對(duì)照組(0mg/L)處理48小時(shí)后在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞呈多角形或菱形,貼壁生長(zhǎng)且可見層疊現(xiàn)象,大小基本一致,均勻分布,增殖相當(dāng)旺盛,少見核固縮現(xiàn)象(Fig.2-A);濃度為20mg/L、80mg/L、320mg/L培養(yǎng)48小時(shí)后的細(xì)胞形態(tài)分別可見(Fig.2-B,Fig.2-C,Fig.2-D),其中濃度為80mg/L、320mg/LEGB作用B16細(xì)胞48小時(shí)后細(xì)胞有顯著變化,部分貼壁細(xì)胞體積變小、變圓、皺縮、脫落,懸浮細(xì)胞增多,可見凋亡小體,隨著濃度的增加,上述變化更明顯,細(xì)胞失去原有的形態(tài)結(jié)構(gòu)。4 PI染色法(FCM)結(jié)果顯示,B16細(xì)胞加藥(銀杏葉提取物濃度20、80、320mg/L)培養(yǎng)48h后,G0/G1期細(xì)胞比例明顯增高(58.767%±1.143%、69.567%±1.089%、75.700%±0.949%),與對(duì)照組(54.983%±1.087%)比較,組內(nèi)及組間差異均具有顯著性(P0.05),而G2/M期(8.533%±0.437%、5.992%±0.270%、4.740%±0.526%)和S期(32.700%±0.965%、24.533%±1.046%、19.617%±1.055%)細(xì)胞比例明顯地減少,與對(duì)照組G2/M期(9.712%±0.668%)(P0.05)和S期(35.467%±1.183%)(P0.05)相比較,組內(nèi)及組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Table 2,Fig.4-1,Fig.4-2)。5 Annexin V/PI染色法(FCM)結(jié)果顯示,B16細(xì)胞加藥(EGB濃度20、80、160mg/L)培養(yǎng)48小時(shí)后,凋亡率隨藥物濃度的增加而顯著升高,細(xì)胞總凋亡率分別為11.7117±1.1929、19.9800±1.9800、25.4200±2.5777,對(duì)照組凋亡率為6.2467±0.8676,實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組及各實(shí)驗(yàn)組間相比,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)(Table 3,Fig.5,Fig.6)。6蛋白質(zhì)印跡(Western blot)結(jié)果顯示,B16細(xì)胞加藥(EGB濃度20、80、320mg/L)培養(yǎng)48小時(shí)后,caspase-3蛋白隨藥物濃度的增加而相應(yīng)增加,B16細(xì)胞內(nèi)caspase-3蛋白相對(duì)表達(dá)量依次為0.40±0.03、0.58±0.04、0.69±0.05,對(duì)照組為0.33±0.02。實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組及各實(shí)驗(yàn)組間相比,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)(Table 4,Fig.7-A,Fig.7-B)。結(jié)論:1 EGB對(duì)B16細(xì)胞具有明顯的增殖抑制作用,導(dǎo)致B16細(xì)胞生長(zhǎng)阻滯。2 EGB可能使細(xì)胞周期阻滯于G0/G1期。3 EGB可能使B16細(xì)胞的細(xì)胞凋亡率增加。4 EGB可能上調(diào)B16細(xì)胞內(nèi)的caspase-3蛋白。5 EGB抑制B16細(xì)胞增殖,使細(xì)胞周期阻滯及誘導(dǎo)凋亡可能是其抗腫瘤機(jī)制之一。因此,為進(jìn)一步作為單獨(dú)或輔助藥物應(yīng)用于治療黑素瘤提供理論基礎(chǔ)及實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
【關(guān)鍵詞】：銀杏葉提取物(EGB) 惡性黑素瘤 B16細(xì)胞 Caspase-3 凋亡
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R739.5
【目錄】：

• 中文摘要4-7
• 英文摘要7-11
• 英文縮寫11-12
• 前言12-13
• 材料與方法13-19
• 結(jié)果19-22
• 附圖22-27
• 附表27-29
• 討論29-32
• 結(jié)論32-33
• 參考文獻(xiàn)33-37
• 綜述 銀杏葉提取物的研究現(xiàn)狀及應(yīng)用37-51
• 參考文獻(xiàn)44-51
• 致謝51-52
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷52

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前3條

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本文編號(hào)：538053