本文關(guān)鍵詞：NID1通過EMT促進(jìn)卵巢癌侵襲轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制研究

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【摘要】：卵巢癌是惡性程度最高的婦科腫瘤,缺乏早期診斷標(biāo)志物、容易早期轉(zhuǎn)移擴(kuò)散以及耐受化療藥物是造成卵巢癌死亡-發(fā)病率(death-incidence ratio)高的重要因素。深入研究卵巢癌發(fā)生發(fā)展尤其是侵襲轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制,并由此制定有效的分子診斷方法與靶向治療策略,對于提高卵巢癌的診治水平并降低死亡率具有重要的理論和現(xiàn)實(shí)意義。NID1 (Nidogen-1)是我們在前期卵巢癌蛋白質(zhì)組研究中篩選并驗(yàn)證的可輔助卵巢癌診斷的候選血漿蛋白標(biāo)志物之一,它在卵巢癌患者血漿中的蛋白水平顯著升高,與其它候選蛋白進(jìn)行聯(lián)合檢測可進(jìn)一步提高診斷靈敏性和特異性。另外,NID1在攜帶淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的卵巢癌患者血漿和腫瘤組織中的水平均高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的卵巢癌患者。NID1作為細(xì)胞外基質(zhì)特化結(jié)構(gòu)——基膜的重要成分,它在卵巢癌發(fā)生發(fā)展中的作用并不清楚。結(jié)合文獻(xiàn)調(diào)研(“腫瘤侵襲、EMT和基膜三者存在密切關(guān)聯(lián)”)和前期臨床數(shù)據(jù)(“卵巢癌樣本中NID1的高表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)”),我們推測NID1極可能在卵巢癌的侵襲轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用。以此為據(jù),本課題從以下四方面深入開展NID1對卵巢癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的影響及其分子機(jī)制的研究,以期為NID1作為候選的卵巢癌預(yù)后標(biāo)志物和治療靶標(biāo)的研究價(jià)值提供科學(xué)依據(jù)。(1)穩(wěn)定過表達(dá)NID1蛋白和瞬時(shí)敲降NID1蛋白的細(xì)胞模型的建立：采用NID1表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染OVCAR-3細(xì)胞并篩選穩(wěn)定的單克隆細(xì)胞株(命名為OVCAR-3-NID1-MC細(xì)胞),采用兩種NID1-siRNA分別瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HEY細(xì)胞獲得HEY-NID1-si798細(xì)胞和HEY-NID1-si2983細(xì)胞。進(jìn)一步采用熒光定量RT-PCR和Western blot鑒定這些細(xì)胞模型,確認(rèn)OVCAR-3-NID1-MC細(xì)胞是穩(wěn)定高表達(dá)NID1蛋白的細(xì)胞模型,而HEY-NID1-si798和]HEY-NID1-si2983細(xì)胞是瞬時(shí)敲降NID1蛋白的細(xì)胞模型。(2)NID1對卵巢癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響：劃痕實(shí)驗(yàn)顯示OVCAR-3-NID1-MC細(xì)胞的側(cè)向遷移速度明顯快于對照細(xì)胞,Transwell侵襲轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)顯示OVCAR-3-NID1-MC細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力和侵襲能力明顯優(yōu)于OVCAR-3-vector,表明過表達(dá)NID1增強(qiáng)卵巢癌細(xì)胞OVCAR-3的遷移和侵襲能力。同樣地,Transwell侵襲轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)顯示,HEY-NID1-si798和HEY-NID1-si2983細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力和侵襲能力弱于對照細(xì)胞,表明敲降NID1減弱卵巢癌細(xì)胞HEY遷移和侵襲能力。(3)NID1對卵巢癌細(xì)胞EMT相關(guān)表型的影響：不同于對照細(xì)胞的“立方形”外形,OVCAR-3-NID1-MC細(xì)胞呈現(xiàn)出“梭形”外形。熒光定量RT-PCR和Western blot結(jié)果顯示OVCAR-3-NID1-MC細(xì)胞的上皮細(xì)胞標(biāo)志分子E-cadherin表達(dá)下降,間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志分子(包括Vimentin和N-cadherin)和EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子Twist-2表達(dá)表達(dá)升高。細(xì)胞免疫熒光的再次證實(shí)了OVCAR-3-NID1-MC細(xì)胞中Vimentin熒光信號更強(qiáng)。與之相對應(yīng),HEY-NID1-si798和HEY-NID1-si2983細(xì)胞與對照細(xì)胞的“梭形”相比更偏“立方形”外形,盡管Vimentin、N-cadherin和Twist-2并沒有發(fā)生預(yù)料中的改變,但Western blot和細(xì)胞免疫熒光結(jié)果均顯示兩種瞬時(shí)敲降NID1的HEY細(xì)胞的E-cadherin表達(dá)都顯著升高。以上結(jié)果表明,NID1促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞發(fā)生EMT。(4)NIDl通過ERK/MAPK通路改變EMT相關(guān)分子表達(dá)：Western blot結(jié)果顯示,OVCAR-3-NID1-MC細(xì)胞中ERK1/2的磷酸化水平顯著高于對照細(xì)胞。經(jīng)ERK/MAPK通路的抑制劑U0126下調(diào)其ERK1/2的磷酸化水平后,E-cadherin、Vimenti、N-cadherin和Twist-2表達(dá)水平出現(xiàn)逆轉(zhuǎn)。以上結(jié)果提示,NID1可通過ERK/MAPK通路改變卵巢癌細(xì)胞EMT相關(guān)分子的表達(dá),促進(jìn)細(xì)胞發(fā)生EMT。另外,Western blot結(jié)果顯示OVCAR-3-NID1-MC細(xì)胞中粘著斑激酶FAK磷酸化水平(磷酸化位點(diǎn)為397位酪氨酸)水平升高,表明FAK處于活化狀態(tài),推測FAK可能是ERK/MAPK通路的上游調(diào)控蛋白。綜上所述,本研究利用穩(wěn)定過表達(dá)NID1蛋白和瞬時(shí)敲降NID1蛋白的細(xì)胞模型,首先發(fā)現(xiàn)NID1促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移,并同時(shí)伴隨著EMT發(fā)生,從而證實(shí)了"NID 1通過EMT促進(jìn)卵巢癌侵襲轉(zhuǎn)移”這一學(xué)術(shù)猜想。然后,在穩(wěn)定過表達(dá)NID1蛋白的細(xì)胞模型中,發(fā)現(xiàn)ERK/MAPK通路處于激活狀態(tài),并且經(jīng)ERK/MAPK通路的抑制劑阻斷該通路后,EMT相關(guān)蛋白的表達(dá)水平絕大多數(shù)都出現(xiàn)逆轉(zhuǎn),從而確定"NID1通過ERK/MAPK通路來促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞的EMT過程”這一分子機(jī)制。同樣地,在穩(wěn)定過表達(dá)NID1蛋白的細(xì)胞模型中,還發(fā)現(xiàn)FAK處于活化狀態(tài),提示NID1可能通過Integrin-FAK通路來激活ERK/MAPK通路,這一點(diǎn)仍需要更多實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的佐證。
【關(guān)鍵詞】：NID1 卵巢癌 轉(zhuǎn)移 侵襲 EMT
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R737.31
【目錄】：

• 英漢縮略語名詞對照5-6
• 中文摘要6-10
• 英文摘要10-14
• 前言14-16
• 1 材料與方法16-22
• 2 結(jié)果22-30
• 3 討論30-36
• 參考文獻(xiàn)36-38
• 文獻(xiàn)綜述38-60
• 參考文獻(xiàn)52-60
• 致謝60-61
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文目錄61

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本文編號：529752