本文關(guān)鍵詞：肝癌HepG2細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激后COX2表達(dá)上調(diào)機(jī)制及其抗凋亡機(jī)制的研究

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【摘要】：目的:明確肝癌Hep G2細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激后COX2表達(dá)上調(diào)的機(jī)制,并對(duì)其抗凋亡的分子機(jī)制進(jìn)行初步探討。方法:免疫組化法檢測(cè)COX2、ATF6、IRE1、PERK的表達(dá)并分析其相關(guān)性;轉(zhuǎn)染si-RNA抑制UPR通路相關(guān)蛋白的表達(dá);RT-q-PCR法檢測(cè)COX2 m RNA的表達(dá);TUNEL法觀察細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)變化;Annexin V+PI雙染流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率;Western blot法檢測(cè)COX2、CHOP、Bcl2、Bax表達(dá)的變化。結(jié)果:1.肝癌組織COX2、ATF6、IRE1、PERK的表達(dá)情況及COX2與ATF6、IRE1、PERK的相關(guān)性分析采用免疫組化法檢測(cè)COX2、ATF6、IRE1、PERK的表達(dá)并分析其相關(guān)性,結(jié)果顯示:164例肝癌患者中,COX2陽(yáng)性患者109例,陰性患者55例;ATF6陽(yáng)性患者134例,陰性患者30例;IRE1陽(yáng)性患者90例,陰性患者74例;PERK陽(yáng)性患者91例,陰性73例。COX2與ATF6的表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.198,P=0.011)。2.si-ATF6、si-IRE1、si-PERK轉(zhuǎn)染效率的檢測(cè)使用倒置熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染后熒光強(qiáng)度,Western blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染后相關(guān)蛋白的表達(dá),最終篩選出si-ATF6-2、si-IRE1-3和si-PERK-3三條同源序列具有較高的轉(zhuǎn)染效率,能分別有效抑制ATF6、IRE1、PERK蛋白的表達(dá)。3.抑制UPR通路對(duì)ERS后Hep G2細(xì)胞COX2表達(dá)的影響3.1 RT-q-PCR法檢測(cè)COX2 m RNA的表達(dá)變化使用RT-q PCR法定量檢測(cè)COX2 m RNA的表達(dá),結(jié)果可見(jiàn):TM組的COX2m RNA表達(dá)相比空白組明顯增加(P0.01),應(yīng)用si-RNA抑制UPR通路后,TM+si-ATF6組COX2 m RNA表達(dá)較TM組和NC組顯著減少(P0.01),而TM+si-IRE1組、TM+si-PERK組的COX2 m RNA的表達(dá)未見(jiàn)明顯變化。使用Western blot法檢測(cè)COX2蛋白的表達(dá)變化。結(jié)果可見(jiàn):TM組與空白組相比COX2蛋白表達(dá)明顯增加(P0.01);TM+si-ATF6組COX2蛋白表達(dá)相比TM組和NC組顯著減少(P0.01)。TM+si-IRE1組、TM+si-PERK組的COX2蛋白的表達(dá)未見(jiàn)明顯變化。4.抑制ATF6表達(dá)對(duì)ERS后Hep G2細(xì)胞凋亡的影響4.1 TUNEL法觀察Hep G2細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)改變使用TUNEL法從形態(tài)學(xué)觀察細(xì)胞凋亡,結(jié)果可見(jiàn):空白對(duì)照組凋亡細(xì)胞百分比為:4.10±0.94%,TM組凋亡細(xì)胞百分比為:15.85±2.43%,TM+NC組凋亡細(xì)胞百分比為:17.42±2.15%;TM+si-ATF6組凋亡細(xì)胞百分比為:34.62±3.28%。TM+si-ATF6組的凋亡細(xì)胞百分比明顯高于TM組(P0.01)和空白對(duì)照組(P0.01)。4.2 FCM檢測(cè)Hep G2細(xì)胞凋亡率使用Annexin V-PI雙染流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡,結(jié)果可見(jiàn):空白對(duì)照組細(xì)胞凋亡率為:4.97±0.34%,TM組凋亡率為:10.87±1.30%,TM+NC組凋亡率為:11.49±2.22%;TM+si-ATF6組凋亡率為:26.95±3.42%。TM+si-ATF6組的細(xì)胞凋亡率較空白對(duì)照組(P0.01)和TM組(P0.01)顯著增加。5.COX2表達(dá)上調(diào)抑制Hep G2細(xì)胞凋亡的機(jī)制探討轉(zhuǎn)染si-ATF6抑制ERS后Hep G2細(xì)胞的COX2表達(dá),用Western blot法檢測(cè)CHOP、Bcl2、Bax蛋白的表達(dá),結(jié)果顯示:TM+si-ATF6組與空白對(duì)照組(P0.01)和TM組(P0.01)相比CHOP表達(dá)明顯增加,Bcl2/Bax比值顯著降低(P0.01)。3.2 Western blot法檢測(cè)COX2蛋白的表達(dá)變化結(jié)論:在ERS后的肝癌Hep G2細(xì)胞中,ATF6通路的激活是COX2表達(dá)上調(diào)的重要機(jī)制之一。ERs后Hep G2細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)的COX2可能通過(guò)抑制CHOP的表達(dá),并上調(diào)Bcl2/Bax比,從而產(chǎn)生凋亡抵抗。
【關(guān)鍵詞】：肝癌 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激 COX2 凋亡 ATF6
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R735.7
【目錄】：

• 中英文縮略詞5-7
• 中文摘要7-9
• 英文摘要9-12
• 1. 前言12-14
• 2. 實(shí)驗(yàn)材料14-17
• 3. 實(shí)驗(yàn)方法17-25
• 4. 結(jié)果25-37
• 5. 討論37-41
• 6. 結(jié)論41-42
• 7. 參考文獻(xiàn)42-48
• 附錄48-49
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷48
• 攻讀碩士期間發(fā)表的論文48
• 參與的科研項(xiàng)目48
• 榮譽(yù)獎(jiǎng)勵(lì)48-49
• 致謝49-50
• 綜述50-61
• 參考文獻(xiàn)55-61

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 Isabel Fabregat;;Dysregulation of apoptosis in hepatocellular carcinoma cells[J];World Journal of Gastroenterology;2009年05期

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本文編號(hào)：523397