發(fā)布時間：2017-07-05 06:28

  本文關(guān)鍵詞：DDX43促進(jìn)AML形成作用及相關(guān)基因OCT4在AML中表達(dá)研究

  更多相關(guān)文章： OCT4 DDX43 急性髓系白血病 腫瘤干細(xì)胞 RQ-PCR

【摘要】：目的:探索腫瘤/睪丸基因DDX43在急性髓系白血病(AML)中的致病機(jī)制。分析DDX43及OCT4等在AML細(xì)胞中的相關(guān)性,研究AML患者中OCT4的表達(dá)狀況及臨床相關(guān)性。方法:1.應(yīng)用RQ-PCR技術(shù)檢測OCT4基因的表達(dá)水平,并使用SPSS20.0軟件對臨床數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。2.構(gòu)建DDX43過表達(dá)的HL60及SHI-1穩(wěn)定細(xì)胞株,應(yīng)用PQ-PCR以及Western Blot技術(shù)從m RNA及蛋白水平檢測DDX43轉(zhuǎn)染AML細(xì)胞中的表達(dá)情況。3.進(jìn)行細(xì)胞生長實驗、生存實驗、周期實驗、分化實驗以及腫瘤球形成實驗,觀察DDX43轉(zhuǎn)染細(xì)胞的增殖、生存及自我更新能力;DDX43轉(zhuǎn)染細(xì)胞皮下接種裸鼠,記錄裸鼠的體重及腫瘤體積變化;裸鼠處死后,用RQ-PCR及Western Blot技術(shù)檢測裸鼠腫瘤中DDX43的表達(dá)狀況。4.運(yùn)用RQ-PCR技術(shù)檢測DDX43轉(zhuǎn)染細(xì)胞中OCT4、NANOG以及C-MYC的表達(dá)水平,另采用Western Blot技術(shù)檢測DDX43轉(zhuǎn)染細(xì)胞中C-MYC的表達(dá)狀況。結(jié)果:1.OCT4在AML中的研究結(jié)果:(1)與對照組相比,AML患者的OCT4基因表達(dá)水平明顯更高(P0.01)。OCT4的表達(dá)水平與患者的性別、年齡、外周血紅蛋白、血小板計數(shù)均無明顯的相關(guān)性(P0.05),但OCT4高表達(dá)組的患者比OCT4低表達(dá)組患者的白細(xì)胞計數(shù)要更高(P=0.001)。另外,M3患者OCT4的高表達(dá)率要明顯低于其他類型的AML患者的OCT4高表達(dá)率(P=0.012)。(2)OCT4表達(dá)水平能夠有效鑒別AML患者和對照組,AUC為0.915(95%的可信區(qū)間為0.837~0.992;P0.001)。當(dāng)OCT4表達(dá)水平0.56時,其靈敏度和特異性分別為75.9%和81.2%。(3)高表達(dá)OCT4的患者和低表達(dá)OCT4的患者的完全緩解率不存在明顯的差異(54%比65%,P0.05)。在所有年齡低于70歲的患者中,我們發(fā)現(xiàn)低OCT4表達(dá)患者比高OCT4表達(dá)的患者OS明顯延長,且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.048)。2.DDX43在AML中的致病機(jī)制的研究成果:(1)DDX43轉(zhuǎn)染細(xì)胞的DDX43表達(dá)量均明顯高于對照組(P0.01)。(2)DDX43轉(zhuǎn)染細(xì)胞生長速度均明顯快于對照組(P0.01);DDX43轉(zhuǎn)染細(xì)胞的生存率均明顯高于對照組(P0.01);在HL60細(xì)胞中,DDX43組的細(xì)胞能夠聚集形成較大腫瘤球,而對照組的細(xì)胞大多散在,不能成球;DDX43的腫瘤球形成率明顯高于對照組(P0.05)。(3)DDX43轉(zhuǎn)染細(xì)胞的周期實驗和分化實驗的結(jié)果與對照組相比無明顯的差異(P0.05)。(4)DDX43組裸鼠的成瘤率明顯高于對照組;DDX43組的腫瘤體積大于對照組,兩者的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);而且DDX43組的腫瘤的生長速度顯著快于對照組,兩組的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01)。DDX43組裸鼠腫瘤中DDX43含量明顯高于對照組,兩組的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01)。(5)在HL60細(xì)胞中,DDX43轉(zhuǎn)染細(xì)胞中OCT4、NANOG、C-MYC的表達(dá)含量均顯著高于對照組(P0.01),另外Western Blot也同樣證實DDX43組的C-MYC的蛋白水平明顯高于對照組。結(jié)論:1.OCT4在AML中表達(dá)水平明顯升高,且OCT4基因可以作為AML預(yù)后不良的重要標(biāo)志物;2.構(gòu)建DDX43-HL60、Mock-HL60、DDX43-SHI-1、Mock-SHI-1細(xì)胞株;3.DDX43能夠在體外促進(jìn)AML細(xì)胞的增殖和生存,且能夠促進(jìn)AML細(xì)胞的自我更新;4.DDX43能夠在體內(nèi)促進(jìn)AML細(xì)胞的腫瘤形成;5.DDX43可能通過介導(dǎo)腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物OCT4、NANOG以及C-MYC從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。
【關(guān)鍵詞】：OCT4 DDX43 急性髓系白血病 腫瘤干細(xì)胞 RQ-PCR
【學(xué)位授予單位】：江蘇大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R733.71
【目錄】：

• 摘要5-8
• ABSTRACT8-16
• 引言16-21
• 1.1 八聚體結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子 4（octamer binding factor 4，，OCT4）16-17
• 1.2 DDX43（DEAD box polypeptide 43）17-19
• 1.3 急性髓系白血�。ˋcute myeloid leukaemia，AML）19-21
• 第一部分 OCT4在急性髓系白血病中表達(dá)的臨床研究21-33
• 第一章 研究的目的、方法及實驗方案的設(shè)計、意義21-23
• 1.1 研究背景及目的21-22
• 1.2 研究方法及技術(shù)22
• 1.2.1 實時定量PCR（RQ-PCR）22
• 1.3 實驗方案22
• 1.4 研究的意義22-23
• 第二章 AML患者中OCT4表達(dá)的臨床研究23-33
• 2.1 實驗材料23-24
• 2.1.1 研究對象23
• 2.1.2 主要試劑23
• 2.1.3 主要儀器23-24
• 2.1.4 引物24
• 2.2 實驗方法24-28
• 2.2.1 單個核細(xì)胞提取和總RNA制備24-25
• 2.2.2 逆轉(zhuǎn)錄25
• 2.2.3 OCT4表達(dá)的RQ-PCR檢測25
• 2.2.4 PCR產(chǎn)物純化與回收25-26
• 2.2.5 重組載體構(gòu)建26
• 2.2.6 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化26
• 2.2.7 重組質(zhì)粒提取及鑒定、測序26-27
• 2.2.8 陽性模板建立27
• 2.2.9 細(xì)胞遺傳學(xué)檢查27
• 2.2.10 統(tǒng)計學(xué)處理27-28
• 2.3 實驗結(jié)果28-31
• 2.3.1 對照組中OCT4轉(zhuǎn)錄本水平28
• 2.3.2 AML患者中OCT4基因轉(zhuǎn)錄本水平28-30
• 2.3.3 OCT4基因表達(dá)具有輔助診斷標(biāo)記意義30
• 2.3.4 OCT4表達(dá)與AML預(yù)后的關(guān)系30-31
• 2.4 討論31-33
• 第二部分 DDX43在AML中的機(jī)制研究33-55
• 第一章 研究目的、方法及實驗方案的設(shè)計、意義33-36
• 1.1 研究目的及背景33-34
• 1.2 實驗方法與技術(shù)34
• 1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)34
• 1.2.2 蛋白印跡法（Western Blot）34
• 1.3 實驗方案34-36
• 1.3.1 DDX43慢病毒載體構(gòu)建及細(xì)胞轉(zhuǎn)染35
• 1.3.2 體外實驗35-36
• 1.3.3 體內(nèi)動物實驗36
• 1.3.4 機(jī)制研究36
• 1.4 研究的意義36
• 第二章 DDX43促進(jìn)AML形成的機(jī)制研究36-55
• 2.1 實驗材料36-39
• 2.1.1 細(xì)胞株36-37
• 2.1.2 實驗動物37
• 2.1.3 引物37
• 2.1.4 主要試劑37-38
• 2.1.5 主要儀器38-39
• 2.2 實驗方法39-46
• 2.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)39
• 2.2.2 細(xì)胞的換液與傳代39
• 2.2.3 細(xì)胞凍存39-40
• 2.2.4 RQ-PCR測定細(xì)胞株中DDX43的表達(dá)40
• 2.2.5 蛋白提取40-41
• 2.2.6 Western Blot測定細(xì)胞株中DDX43的表達(dá)41-43
• 2.2.7 生長實驗43-44
• 2.2.8 生存實驗44
• 2.2.9 周期實驗44-45
• 2.2.10 分化實驗45
• 2.2.11 腫瘤球形成實驗45-46
• 2.2.12 裸鼠致瘤實驗46
• 2.3 實驗結(jié)果46-52
• 2.3.1 熒光下的DDX43細(xì)胞46
• 2.3.2 RQ-PCR檢測DDX43在細(xì)胞株中的表達(dá)狀況46-47
• 2.3.3 Western Blot檢測DDX43在細(xì)胞株中的表達(dá)狀況47
• 2.3.4 生長實驗47-48
• 2.3.5 生存實驗48
• 2.3.6 周期實驗48-49
• 2.3.7 分化實驗49-50
• 2.3.8 腫瘤球形成實驗50
• 2.3.9 裸鼠致瘤實驗50-51
• 2.3.10 裸鼠腫瘤中DDX43的表達(dá)狀況51
• 2.3.11 機(jī)制研究51-52
• 2.4 討論52-55
• 結(jié)論和展望55-56
• 1.1 主要結(jié)論55
• 1.2 展望55-56
• 參考文獻(xiàn)56-66
• 致謝66-67
• 攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文及其他科研成果67

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本文編號：520867