本文關(guān)鍵詞：無義突變RB1和MEN1抑癌基因的翻譯調(diào)控及通讀研究

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【摘要】：基因的無義突變?cè)诩?xì)胞內(nèi)產(chǎn)生了含有提前終止密碼子(premature translation termination codon, PTC)的異常mRNA。這些含有PTC的mRNA在第一輪翻譯過程中被細(xì)胞內(nèi)的無義突變介導(dǎo)的mRNA降解途徑(nonsense-mediated mRNA decay, NMD)所識(shí)別和降解,從而消除這種mRNA翻譯產(chǎn)生的截短的、有毒的蛋白質(zhì)對(duì)機(jī)體的危害。NMD途徑是一種重要的真核生物基因轉(zhuǎn)錄后監(jiān)督機(jī)制,是基因表達(dá)的翻譯調(diào)控(translation control)。研究發(fā)現(xiàn),許多癌癥和腫瘤的致病原因是由于無義突變導(dǎo)致抑癌基因表達(dá)水平嚴(yán)重降低或缺失。因此,抑癌基因無義突變及其翻譯調(diào)控的研究,有助于揭示基因突變引發(fā)癌癥的發(fā)病機(jī)制。成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤(retinoblastoma, RB)是嬰幼兒眼內(nèi)惡性腫瘤中最常見的一種。1971年,Kundson等人鑒定出了該疾病的致病基因RB1,研究發(fā)現(xiàn)該腫瘤的形成是由于第13號(hào)染色體(13q14)上一對(duì)等位基因的同時(shí)缺失或失活導(dǎo)致的,表明該基因具有抑制腫瘤形成的作用,并首次提出了腫瘤抑制基因(tumor suppressor gene)的概念。RBGMdb數(shù)據(jù)庫(http://rb 1-1sdb.d-lohmann.de/)顯示,所有由RB1基因突變引起的成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤病例中,無義突變占到了42.4%。本研究第一部分以RB1基因作為研究對(duì)象,探討無義突變RB1基因的表達(dá)調(diào)控機(jī)制。首先,構(gòu)建了mini-RB1小基因,包括外顯子1～14(cDNA)、內(nèi)含子14-外顯子15-內(nèi)含子15和外顯子16～27(cDNA)三部分序列,將其克隆到真核表達(dá)載體pCMV-MH中。根據(jù)人類基因組突變數(shù)據(jù)庫,選擇3個(gè)RB1基因的無義突變位點(diǎn)W99X、G310X和R467X,并構(gòu)建相應(yīng)的無義突變體。分別將mini-RBI基因野生型和無義突變體轉(zhuǎn)入HeLa細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)。qRT-PCR分析結(jié)果顯示,3個(gè)無義突變體與野生型相比mRNA水平均無顯著差異,表明無義突變體mini-RB1可能發(fā)生了NMD逃逸現(xiàn)象。為了進(jìn)一步證實(shí)以上結(jié)果,我們利用NMD抑制劑放線菌酮和轉(zhuǎn)錄抑制劑放線菌素D,分別處理轉(zhuǎn)入野生型mini-RB1基因及其無義突變體W99X和G310X的哺乳動(dòng)物細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)處理前后的mini-RB1基因無義突變體的mRNA水平與野生型無明顯差異,進(jìn)一步說明含有W99X或G310X無義突變的mini-RBI基因的mRNA的確發(fā)生了NMD逃逸。Western blot分析mini-RB1基因的蛋白質(zhì)表達(dá)水平,發(fā)現(xiàn)在無義突變位點(diǎn)W99X和G310X下游重新起始了蛋白質(zhì)的翻譯。由此,我們認(rèn)為PTC下游翻譯的重新起始可能是導(dǎo)致無義mRNA逃逸NMD途徑監(jiān)控的主要原因之一。對(duì)于基因無義突變導(dǎo)致的遺傳性疾病(例如,囊性纖維化、血友病等)和腫瘤的治療研究,主要集中于基因通讀藥物,如氨基糖甙類藥物和小分子化合物PTC124,以及臨床藥物,如Amlexanox(用于口腔潰瘍的治療)。藥物處理后在細(xì)胞或機(jī)體中能夠檢測(cè)到全長(zhǎng)目的蛋白質(zhì)表達(dá)量的提高。通讀藥物在一定程度上可以緩解疾病的臨床癥狀。但由于NMD途徑的監(jiān)控,細(xì)胞內(nèi)無義突變基因產(chǎn)生的mRNA被降解,作為通讀藥物的底物,由于含量很低,使全長(zhǎng)蛋白質(zhì)的表達(dá)量受到限制。本研究的第二部分主要以受NMD途徑調(diào)控的MEN1(多發(fā)性內(nèi)分泌腺瘤Ⅰ型)基因?yàn)檠芯繉?duì)象,研究NMD途徑抑制藥物和通讀藥物的聯(lián)合作用對(duì)有效提高全長(zhǎng)Menin蛋白表達(dá)水平的協(xié)同作用。首先,我們將含有MEN1小基因及其無義突變體M1(Q141X),M2(Y312X),M3(Y312X)和M4(Y417X)的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入HeLa細(xì)胞中,然后用不同濃度的通讀藥物PTC124(0,2,10,20μM)和Amlexanox(0,5,10,100μ.M)處理細(xì)胞,通過Western blot檢測(cè)兩種藥物對(duì)4個(gè)無義突變體全長(zhǎng)Menin蛋白表達(dá)的恢復(fù)效果。確定PTC124和Amlexanox的促通讀作用的最適濃度分別為20μM和100μM。然后,分別用RNAi和microRNA方法抑制NMD途徑,即用pSIR-UPF1和miR125a分別處理轉(zhuǎn)染MEN1小基因及其無義突變體的HeLa細(xì)胞。Western blot分析發(fā)現(xiàn),抑制NMD途徑的同時(shí)用通讀藥物處理可以明顯提高無義突變的MEN1基因在細(xì)胞中表達(dá)水平,產(chǎn)生的全長(zhǎng)Menin蛋白的水平相對(duì)于未處理對(duì)照最高達(dá)10倍。qRT-PCR分析聯(lián)合處理后細(xì)胞中無義突變MEN1基因的mRNA水平,發(fā)現(xiàn)兩種NMD抑制藥物均增加了mRNA水平,而通讀藥物PTC124一定程度降低了mRNA水平,Amlexanox增加了mRNA水平。兩種藥物聯(lián)合處理后MEN1的mRNA水平均有相應(yīng)的增加。綜合以上結(jié)果,我們認(rèn)為,NMD抑制藥物和基因通讀藥物的聯(lián)合作用,通過提高異常mRNA在細(xì)胞中的含量,增加了通讀藥物的作用底物,使得細(xì)胞中全長(zhǎng)Menin蛋白質(zhì)水平有明顯提高。研究結(jié)果為無義突變導(dǎo)致的相關(guān)疾病的研究和臨床治療方案的制定提供了重要思路和基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。
【關(guān)鍵詞】：RB1基因 MEN1基因 NMD途徑 基因通讀
【學(xué)位授予單位】：山西大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R730.2;Q78
【目錄】：

• 中文摘要10-12
• Abstract12-15
• 第一章 文獻(xiàn)綜述15-23
• 1.1 NMD途徑15-18
• 1.1.1 NMD途徑的分子機(jī)制15-16
• 1.1.2 NMD途徑中的作用因子16
• 1.1.3 NMD逃逸(NMD-escape)和NMD不敏感(NMD-irrelevant)16-17
• 1.1.4 NMD途徑與疾病17-18
• 1.2 RB1基因簡(jiǎn)介18-19
• 1.2.1 成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤疾病18
• 1.2.2 RB1基因18-19
• 1.3 MEN1基因簡(jiǎn)介19-20
• 1.3.1 多發(fā)性內(nèi)分泌腫瘤Ⅰ型疾病19
• 1.3.2 MEN1基因19-20
• 1.4 通讀藥物簡(jiǎn)介20-21
• 1.4.1 無義突變基因的通讀作用20-21
• 1.4.2 通讀藥物及其發(fā)展現(xiàn)狀21
• 1.5 本課題的研究思路、目的和意義21-23
• 第二章 RB1小基因野生型及無義突變體的構(gòu)建與表達(dá)23-35
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料23-25
• 2.1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞株、菌株和載體23
• 2.1.2 主要的酶與試劑23
• 2.1.3 主要試劑配制方法23-25
• 2.1.4 主要儀器25
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法25-32
• 2.2.1 mini-RB1小基因的構(gòu)建25-29
• 2.2.2 mini-RB1小基因無義突變體的構(gòu)建29-30
• 2.2.3 哺乳動(dòng)物細(xì)胞HEK-293T的培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染30-31
• 2.2.4 Western印跡檢測(cè)mini-RB1小基因的表達(dá)31-32
• 2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果32-33
• 2.3.1 mini-RB1基因的構(gòu)建與表達(dá)32-33
• 2.3.2 mini-RB1基因無義突變體的構(gòu)建33
• 2.4 討論33-35
• 第三章 無義突變的RB1小基因的NMD逃逸35-42
• 3.1 實(shí)驗(yàn)材料35-36
• 3.1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞株和質(zhì)粒35
• 3.1.2 主要的酶與試劑35
• 3.1.3 主要儀器35
• 3.1.4 主要試劑配制方法35-36
• 3.2 實(shí)驗(yàn)方法36-38
• 3.2.1 細(xì)胞中總RNA的提取36
• 3.2.2 去基因組反轉(zhuǎn)錄PCR(Reverse Transcript PCR,RT-PCR)36-37
• 3.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(quantify Real-Time PCR,qRT-PCR)37-38
• 3.2.4 Western Blot檢測(cè)mini-RB1野生型與突變體蛋白質(zhì)表達(dá)38
• 3.2.5 HeLa細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染38
• 3.2.6 細(xì)胞的藥物處理38
• 3.2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析38
• 3.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果38-41
• 3.3.1 mini-RB1基因無義突變體mRNA水平的測(cè)定38-39
• 3.3.2 mini-RB1基因無義突變體W99X和G310X發(fā)生NMD逃逸39
• 3.3.3 W99X和G310X無義突變體PTC下游翻譯的重新起始39-41
• 3.4 討論41-42
• 第四章 MEN1基因的通讀藥物研究42-55
• 4.1 實(shí)驗(yàn)材料42-44
• 4.1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞株與質(zhì)粒42-43
• 4.1.2 主要試劑43
• 4.1.3 主要試劑配制方法43-44
• 4.2 實(shí)驗(yàn)方法44-47
• 4.2.1 不同濃度的通讀藥物處理HeLa細(xì)胞44
• 4.2.2 NMD途徑抑制藥物與通讀藥物聯(lián)合處理HeLa細(xì)胞44-45
• 4.2.3 灰度掃描分析Western Blot結(jié)果45
• 4.2.4 含有MEN1基因野生型或無義突變體的HeLa細(xì)胞穩(wěn)定株的構(gòu)建45-46
• 4.2.5 qRT-PCR檢測(cè)MEN1基因的mRNA水平46-47
• 4.2.6 qRT-PCR數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析47
• 4.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果47-52
• 4.3.1 篩選通讀藥物PTC124和Amlexanox的最適濃度47
• 4.3.2 NMD抑制藥物提高了通讀藥物對(duì)全長(zhǎng)Menin蛋白表達(dá)的恢復(fù)作用47-49
• 4.3.3 含有MEN1基因野生型或無義突變體的HeLa細(xì)胞穩(wěn)定株的構(gòu)建49-51
• 4.3.4 NMD抑制藥物和通讀藥物的聯(lián)合處理對(duì)無義突變的MEN1基因mRNA水平的影響51-52
• 4.4 討論52-55
• 總結(jié)與展望55-58
• 參考文獻(xiàn)58-63
• 附錄 略語表63-64
• 攻讀學(xué)位期間取得的研究成果64-65
• 致謝65-67
• 個(gè)人簡(jiǎn)況及聯(lián)系方式67-68
• 承諾書68-69

【共引文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 周勇;楊潔;李恒進(jìn);;早熟終止密碼子通讀治療遺傳性癌癥綜合征的研究進(jìn)展[J];腫瘤預(yù)防與治療;2014年02期

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本文編號(hào)：520464