本文關(guān)鍵詞：富馬酸二甲酯抑制和保護(hù)惡性黑色素瘤細(xì)胞的雙重作用以及干預(yù)機(jī)制的研究

  更多相關(guān)文章： 黑色素瘤 DMF 細(xì)胞增殖 細(xì)胞凋亡 p62 Nrf2 自噬

【摘要】：目的:研究富馬酸二甲酯(Dimethyl Fumarate,DMF)抑制與保護(hù)人惡性黑色素瘤細(xì)胞的雙重作用,探討增強(qiáng)DMF抗腫瘤效果的方法與機(jī)制。方法:應(yīng)用MTT法與克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)不同濃度DMF對(duì)A375細(xì)胞增殖的影響。細(xì)胞分別經(jīng)DNA染色,AnnexinV/PI染色或CMFDA標(biāo)記后,通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期分布,細(xì)胞凋亡率以及細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽水平。用Western blot技術(shù)與q-PCR技術(shù)分別檢測(cè)自噬與凋亡相關(guān)的蛋白和mRNA表達(dá)水平,并用免疫熒光染色技術(shù)觀察DMF處理后細(xì)胞自噬的形態(tài)特征。應(yīng)用雙熒光素酶報(bào)告基因技術(shù)檢測(cè)DMF對(duì)Nrf2信號(hào)通路的調(diào)節(jié)作用,并通過(guò)SiRNA轉(zhuǎn)染沉默Nrf2和p62蛋白表達(dá),然后通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)檢測(cè)DMF對(duì)腫瘤細(xì)胞凋亡的影響。結(jié)果:DMF在25-100μmol/L濃度范圍內(nèi)可明顯地抑制A375腫瘤細(xì)胞的增殖。當(dāng)濃度達(dá)到50μmol/L時(shí),腫瘤細(xì)胞幾乎完全失去克隆形成能力。細(xì)胞周期結(jié)果顯示,低劑量DMF(50μmol/L)導(dǎo)致S期細(xì)胞減少50%,高劑量DMF(100μmol/L)則導(dǎo)致顯著的G2/M期細(xì)胞阻滯。DMF在25-100μmol/L濃度范圍內(nèi)可以劑量依賴(lài)方式誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡增加,并伴隨著Caspase-3活化和PARP-1蛋白裂解。DMF導(dǎo)致A375細(xì)胞谷胱甘肽(GSH)水平降低,用氧自由基抑制劑N-乙酰半胱氨酸(NAC)預(yù)處理細(xì)胞,能逆轉(zhuǎn)DMF誘導(dǎo)的細(xì)胞周期改變。DMF也通過(guò)激活Nrf2信號(hào)通路和增強(qiáng)細(xì)胞自噬誘導(dǎo)A375腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生保護(hù)反應(yīng)。DMF處理導(dǎo)致Nrf2報(bào)告基因活性增強(qiáng),并伴有靶基因HO-1,NQO-1轉(zhuǎn)錄增加。DMF同步上調(diào)p62和Nrf2的蛋白與mRNA水平,提示二者形成正反饋環(huán)路。DMF處理的細(xì)胞表現(xiàn)出自噬增強(qiáng)的特征,表現(xiàn)為L(zhǎng)C3-II蛋白轉(zhuǎn)化增加,LC3免疫熒光染色呈點(diǎn)狀分布并與溶酶體標(biāo)記蛋白LAMP-1重合,這提示自噬溶酶體形成。用特異的SiRNA沉默Nrf2,可明顯增加DMF誘導(dǎo)A375細(xì)胞凋亡的能力。結(jié)論:DMF可顯著地抑制人惡性黑色素瘤細(xì)胞A375的增殖與克隆形成,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。另外DMF也通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞自噬和激活Nrf2信號(hào)通路使腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生藥物抵抗。抑制Nrf2信號(hào)通路可增強(qiáng)DMF對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用。
【關(guān)鍵詞】：黑色素瘤 DMF 細(xì)胞增殖 細(xì)胞凋亡 p62 Nrf2 自噬
【學(xué)位授予單位】：大連大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：R739.5
【目錄】：

• 摘要5-6
• Abstract6-11
• 引言11-12
• 1 文獻(xiàn)綜述12-19
• 1.1 富馬酸二甲酯及其主要的藥理作用12-13
• 1.2 DMF用于腫瘤治療的研究13-18
• 1.2.1 DMF的抗腫瘤作用機(jī)制13-14
• 1.2.1.1 干擾腫瘤細(xì)胞的氧化還原狀態(tài)13-14
• 1.2.1.2 DMF顯著抑制NF kappa B的活性14
• 1.2.1.3 DMF抑制腫瘤血管新生14
• 1.2.1.4 DMF抑制腫瘤細(xì)胞侵襲與轉(zhuǎn)移14
• 1.2.2 DMF的保護(hù)腫瘤作用機(jī)制14-18
• 1.2.2.1 激活Nrf2信號(hào)通路14-17
• 1.2.2.2 調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬功能17-18
• 1.3 結(jié)束語(yǔ)18-19
• 2 DMF對(duì)惡性黑色素瘤細(xì)胞的抗腫瘤作用研究19-40
• 2.1 引言19
• 2.2 實(shí)驗(yàn)材料19-24
• 2.2.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞19
• 2.2.2 主要器材19-20
• 2.2.3 主要試劑20-22
• 2.2.4 試劑的配制22-24
• 2.3 實(shí)驗(yàn)方法24-28
• 2.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)24
• 2.3.2 MTT實(shí)驗(yàn)24-25
• 2.3.3 克隆形成實(shí)驗(yàn)25
• 2.3.4 細(xì)胞周期分析25
• 2.3.5 細(xì)胞凋亡檢測(cè)25-26
• 2.3.6 谷胱甘肽水平的檢測(cè)26
• 2.3.7 細(xì)胞總蛋白的提取與定量26
• 2.3.8 免疫印跡檢測(cè)蛋白表達(dá)水平26-28
• 2.3.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理28
• 2.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果28-38
• 2.4.1 DMF抑制A375細(xì)胞增殖和克隆形成28-30
• 2.4.2 DMF誘導(dǎo)A375細(xì)胞發(fā)生G2期和有絲分裂期阻滯30-32
• 2.4.3 DMF處理誘導(dǎo)A375細(xì)胞凋亡32-33
• 2.4.4 DMF降低細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽水平33-35
• 2.4.5 GSH水平對(duì)DMF誘導(dǎo)細(xì)胞周期改變的重要性大于細(xì)胞死亡35-38
• 2.5 討論38-39
• 2.6 小結(jié)39-40
• 3 DMF誘導(dǎo)惡性黑色素瘤細(xì)胞產(chǎn)生藥物抵抗的研究40-53
• 3.1 引言40-43
• 3.1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞40
• 3.1.2 主要器材40-41
• 3.1.3 主要試劑41-42
• 3.1.4 試劑的配制42-43
• 3.2 實(shí)驗(yàn)方法43-47
• 3.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)43
• 3.2.2 免疫印跡檢測(cè)蛋白表達(dá)水平43
• 3.2.3 細(xì)胞總RNA的提取與定量43-44
• 3.2.4 多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)44-45
• 3.2.4.1 第一鏈cDNA的合成44
• 3.2.4.2 PCR擴(kuò)增44
• 3.2.4.3 PCR產(chǎn)物的鑒定44-45
• 3.2.5 實(shí)時(shí)定量PCR45
• 3.2.6 免疫熒光染色和共聚焦顯微鏡觀察45-46
• 3.2.7 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)46-47
• 3.2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理47
• 3.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果47-51
• 3.3.1 DMF增強(qiáng)A375細(xì)胞的自噬功能47-49
• 3.3.2 DMF激活Nrf2介導(dǎo)的信號(hào)系統(tǒng)49-50
• 3.3.3 DMF誘導(dǎo)A375細(xì)胞形成p62-Nrf2正反饋信號(hào)環(huán)路50-51
• 3.4 討論51-52
• 3.5 小結(jié)52-53
• 4 干預(yù)Nrf2信號(hào)通路增強(qiáng)DMF殺傷腫瘤細(xì)胞的研究53-60
• 4.1 引言53
• 4.2 實(shí)驗(yàn)材料53-55
• 4.2.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞53
• 4.2.2 主要器材53-54
• 4.2.3 主要試劑54
• 4.2.4 試劑的配制54-55
• 4.3 實(shí)驗(yàn)方法55-56
• 4.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)55
• 4.3.2 SiRNA法沉默基因Nrf2與p6255-56
• 4.3.3 基因沉默效果的鑒定56
• 4.3.3.1 多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR法）56
• 4.3.3.2 免疫印跡法56
• 4.3.4 細(xì)胞凋亡檢測(cè)56
• 4.3.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理56
• 4.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果56-59
• 4.4.1 SiRNA轉(zhuǎn)染沉默Nrf2與p62基因表達(dá)56-57
• 4.4.2 沉默Nrf2增強(qiáng)DMF誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡57-59
• 4.5 討論59
• 4.6 小結(jié)59-60
• 結(jié)論60-61
• 參考文獻(xiàn)61-67
• 附錄A 附錄縮略語(yǔ)67-68
• 攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表學(xué)術(shù)論文情況68-69
• 致謝69-70

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5 李明輝;“細(xì)胞凋亡”治癌癥[N];醫(yī)藥導(dǎo)報(bào);2002年

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