本文關鍵詞：富馬酸二甲酯抑制和保護惡性黑色素瘤細胞的雙重作用以及干預機制的研究

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【摘要】：目的:研究富馬酸二甲酯(Dimethyl Fumarate,DMF)抑制與保護人惡性黑色素瘤細胞的雙重作用,探討增強DMF抗腫瘤效果的方法與機制。方法:應用MTT法與克隆形成實驗檢測不同濃度DMF對A375細胞增殖的影響。細胞分別經(jīng)DNA染色,AnnexinV/PI染色或CMFDA標記后,通過流式細胞儀檢測細胞周期分布,細胞凋亡率以及細胞內(nèi)谷胱甘肽水平。用Western blot技術與q-PCR技術分別檢測自噬與凋亡相關的蛋白和mRNA表達水平,并用免疫熒光染色技術觀察DMF處理后細胞自噬的形態(tài)特征。應用雙熒光素酶報告基因技術檢測DMF對Nrf2信號通路的調(diào)節(jié)作用,并通過SiRNA轉(zhuǎn)染沉默Nrf2和p62蛋白表達,然后通過流式細胞術檢測檢測DMF對腫瘤細胞凋亡的影響。結(jié)果:DMF在25-100μmol/L濃度范圍內(nèi)可明顯地抑制A375腫瘤細胞的增殖。當濃度達到50μmol/L時,腫瘤細胞幾乎完全失去克隆形成能力。細胞周期結(jié)果顯示,低劑量DMF(50μmol/L)導致S期細胞減少50%,高劑量DMF(100μmol/L)則導致顯著的G2/M期細胞阻滯。DMF在25-100μmol/L濃度范圍內(nèi)可以劑量依賴方式誘導細胞凋亡增加,并伴隨著Caspase-3活化和PARP-1蛋白裂解。DMF導致A375細胞谷胱甘肽(GSH)水平降低,用氧自由基抑制劑N-乙酰半胱氨酸(NAC)預處理細胞,能逆轉(zhuǎn)DMF誘導的細胞周期改變。DMF也通過激活Nrf2信號通路和增強細胞自噬誘導A375腫瘤細胞產(chǎn)生保護反應。DMF處理導致Nrf2報告基因活性增強,并伴有靶基因HO-1,NQO-1轉(zhuǎn)錄增加。DMF同步上調(diào)p62和Nrf2的蛋白與mRNA水平,提示二者形成正反饋環(huán)路。DMF處理的細胞表現(xiàn)出自噬增強的特征,表現(xiàn)為LC3-II蛋白轉(zhuǎn)化增加,LC3免疫熒光染色呈點狀分布并與溶酶體標記蛋白LAMP-1重合,這提示自噬溶酶體形成。用特異的SiRNA沉默Nrf2,可明顯增加DMF誘導A375細胞凋亡的能力。結(jié)論:DMF可顯著地抑制人惡性黑色素瘤細胞A375的增殖與克隆形成,誘導細胞凋亡。另外DMF也通過誘導細胞自噬和激活Nrf2信號通路使腫瘤細胞產(chǎn)生藥物抵抗。抑制Nrf2信號通路可增強DMF對腫瘤細胞的殺傷作用。
【關鍵詞】：黑色素瘤 DMF 細胞增殖 細胞凋亡 p62 Nrf2 自噬
【學位授予單位】：大連大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R739.5
【目錄】：

• 摘要5-6
• Abstract6-11
• 引言11-12
• 1 文獻綜述12-19
• 1.1 富馬酸二甲酯及其主要的藥理作用12-13
• 1.2 DMF用于腫瘤治療的研究13-18
• 1.2.1 DMF的抗腫瘤作用機制13-14
• 1.2.1.1 干擾腫瘤細胞的氧化還原狀態(tài)13-14
• 1.2.1.2 DMF顯著抑制NF kappa B的活性14
• 1.2.1.3 DMF抑制腫瘤血管新生14
• 1.2.1.4 DMF抑制腫瘤細胞侵襲與轉(zhuǎn)移14
• 1.2.2 DMF的保護腫瘤作用機制14-18
• 1.2.2.1 激活Nrf2信號通路14-17
• 1.2.2.2 調(diào)節(jié)細胞自噬功能17-18
• 1.3 結(jié)束語18-19
• 2 DMF對惡性黑色素瘤細胞的抗腫瘤作用研究19-40
• 2.1 引言19
• 2.2 實驗材料19-24
• 2.2.1 實驗細胞19
• 2.2.2 主要器材19-20
• 2.2.3 主要試劑20-22
• 2.2.4 試劑的配制22-24
• 2.3 實驗方法24-28
• 2.3.1 細胞培養(yǎng)24
• 2.3.2 MTT實驗24-25
• 2.3.3 克隆形成實驗25
• 2.3.4 細胞周期分析25
• 2.3.5 細胞凋亡檢測25-26
• 2.3.6 谷胱甘肽水平的檢測26
• 2.3.7 細胞總蛋白的提取與定量26
• 2.3.8 免疫印跡檢測蛋白表達水平26-28
• 2.3.9 統(tǒng)計學處理28
• 2.4 實驗結(jié)果28-38
• 2.4.1 DMF抑制A375細胞增殖和克隆形成28-30
• 2.4.2 DMF誘導A375細胞發(fā)生G2期和有絲分裂期阻滯30-32
• 2.4.3 DMF處理誘導A375細胞凋亡32-33
• 2.4.4 DMF降低細胞內(nèi)谷胱甘肽水平33-35
• 2.4.5 GSH水平對DMF誘導細胞周期改變的重要性大于細胞死亡35-38
• 2.5 討論38-39
• 2.6 小結(jié)39-40
• 3 DMF誘導惡性黑色素瘤細胞產(chǎn)生藥物抵抗的研究40-53
• 3.1 引言40-43
• 3.1.1 實驗細胞40
• 3.1.2 主要器材40-41
• 3.1.3 主要試劑41-42
• 3.1.4 試劑的配制42-43
• 3.2 實驗方法43-47
• 3.2.1 細胞培養(yǎng)43
• 3.2.2 免疫印跡檢測蛋白表達水平43
• 3.2.3 細胞總RNA的提取與定量43-44
• 3.2.4 多聚酶鏈式反應44-45
• 3.2.4.1 第一鏈cDNA的合成44
• 3.2.4.2 PCR擴增44
• 3.2.4.3 PCR產(chǎn)物的鑒定44-45
• 3.2.5 實時定量PCR45
• 3.2.6 免疫熒光染色和共聚焦顯微鏡觀察45-46
• 3.2.7 雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?/span>46-47
• 3.2.8 統(tǒng)計學處理47
• 3.3 實驗結(jié)果47-51
• 3.3.1 DMF增強A375細胞的自噬功能47-49
• 3.3.2 DMF激活Nrf2介導的信號系統(tǒng)49-50
• 3.3.3 DMF誘導A375細胞形成p62-Nrf2正反饋信號環(huán)路50-51
• 3.4 討論51-52
• 3.5 小結(jié)52-53
• 4 干預Nrf2信號通路增強DMF殺傷腫瘤細胞的研究53-60
• 4.1 引言53
• 4.2 實驗材料53-55
• 4.2.1 實驗細胞53
• 4.2.2 主要器材53-54
• 4.2.3 主要試劑54
• 4.2.4 試劑的配制54-55
• 4.3 實驗方法55-56
• 4.3.1 細胞培養(yǎng)55
• 4.3.2 SiRNA法沉默基因Nrf2與p6255-56
• 4.3.3 基因沉默效果的鑒定56
• 4.3.3.1 多聚酶鏈式反應（PCR法）56
• 4.3.3.2 免疫印跡法56
• 4.3.4 細胞凋亡檢測56
• 4.3.5 統(tǒng)計學處理56
• 4.4 實驗結(jié)果56-59
• 4.4.1 SiRNA轉(zhuǎn)染沉默Nrf2與p62基因表達56-57
• 4.4.2 沉默Nrf2增強DMF誘導的細胞凋亡57-59
• 4.5 討論59
• 4.6 小結(jié)59-60
• 結(jié)論60-61
• 參考文獻61-67
• 附錄A 附錄縮略語67-68
• 攻讀碩士學位期間發(fā)表學術論文情況68-69
• 致謝69-70

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