本文關(guān)鍵詞：兩條VEGFR靶向分子探針的修飾及作用靶點(diǎn)的初步研究

  更多相關(guān)文章： 多肽 分子探針 腫瘤靶向 受體 血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子

【摘要】：研究背景及目的腫瘤的分子顯像和靶向治療是以腫瘤相關(guān)分子為靶點(diǎn),將分子探針或靶向藥物特異地定位于腫瘤實(shí)質(zhì)細(xì)胞或腫瘤間質(zhì),從而達(dá)到腫瘤顯像或治療的目的。由于其具有定向、定位、特異性強(qiáng)的優(yōu)勢(shì),逐漸成為核醫(yī)學(xué)及腫瘤學(xué)研究領(lǐng)域的熱點(diǎn),為腫瘤的診治帶來(lái)了新的希望。其中腫瘤特異靶點(diǎn)的選擇及分子探針的篩選是分子顯像及靶向治療能否成功的關(guān)鍵。VEGF/VEGFR具有高的瘤/非瘤比值,與腫瘤血管生成及腫瘤的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移密切相關(guān),為腫瘤診治研究的重要靶點(diǎn),以其為靶點(diǎn)設(shè)計(jì)的分子探針既可用于腫瘤顯像,也可作為靶向藥物用于腫瘤的治療。本課題組前期以VEGFR為靶點(diǎn),通過(guò)生物信息學(xué)法篩選到2條多肽QKRKRKKSRKKH、RKRKRKKSRYIVLS,體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)均證實(shí)它們?yōu)槟[瘤靶向抑制肽,可作為侯選的分子探針或靶向藥物用于腫瘤的核素分子顯像及靶向治療。但這2條分子探針在血清中可能易被降解、其作用位點(diǎn)也尚不清楚,如何增強(qiáng)其在血清中的穩(wěn)定性并進(jìn)一步探討其作用位點(diǎn),對(duì)完善其腫瘤靶向機(jī)制、抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的分子機(jī)制具有重要意義。故本研究旨在對(duì)這2條腫瘤分子探針進(jìn)行保護(hù)性化學(xué)修飾,以提高其在血清中的穩(wěn)定性,并進(jìn)一步探討其作用位點(diǎn),為其作為分子探針及靶向藥物用于腫瘤的分子顯像及靶向治療奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。方法1.多肽保護(hù)性化學(xué)修飾前后的穩(wěn)定性研究:人工合成多肽,并對(duì)其進(jìn)行N端乙�；�(Ac)、C端酰胺化(NH2)修飾;3H-Td R摻入實(shí)驗(yàn)、CCK-8細(xì)胞實(shí)驗(yàn)比較多肽修飾前后對(duì)A549細(xì)胞增殖的抑制能力,transwell實(shí)驗(yàn)比較多肽修飾前后對(duì)A549細(xì)胞遷移的抑制能力,間接評(píng)價(jià)其穩(wěn)定性;高壓液相色譜法(HPLC)測(cè)定血清環(huán)境下不同時(shí)間點(diǎn)多肽剩余量,直接評(píng)價(jià)其穩(wěn)定性。2.構(gòu)建原核表達(dá)載體p GEX4T-1-多肽,轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)的感受態(tài)細(xì)胞,誘導(dǎo)表達(dá)GST-多肽融合蛋白;谷胱甘肽瓊脂糖凝膠4B(Glutathione Sepharose 4B)對(duì)融合蛋白進(jìn)行純化;蛋白電泳鑒定其表達(dá)及純化效果;免疫共沉淀方法鑒定GST-多肽與VEGFR亞型(VEGFR-1或VEGFR-2)的結(jié)合。3.多肽處理A549細(xì)胞,Western Blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)多肽對(duì)細(xì)胞中VEGFR-1和VEGFR-2磷酸化水平的影響。4.RNAi技術(shù)沉默VEGF表達(dá),即轉(zhuǎn)染si RNA至A549細(xì)胞,Western Blot方法鑒定VEGF蛋白表達(dá)水平;CCK-8細(xì)胞實(shí)驗(yàn)探討細(xì)胞培養(yǎng)體系中無(wú)內(nèi)、外源性VEGF時(shí),多肽對(duì)A549細(xì)胞增殖的抑制能力。5.生物信息學(xué)手段,即分子對(duì)接法及動(dòng)力學(xué)模擬技術(shù)理論上預(yù)測(cè)多肽的潛在作用靶點(diǎn);體外受體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合及免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)對(duì)多肽理論上的作用靶點(diǎn)進(jìn)一步鑒定。結(jié)果1.多肽RKRKRKKSRYIVLS經(jīng)化學(xué)修飾后在10%血清環(huán)境下對(duì)A549細(xì)胞增殖的抑制率由(2.63±6.19)%提高至(48.50±7.14)%(P0.01);細(xì)胞活力的抑制率由(1.30±7.90)%提高至(20.80±5.90)%(P0.01);對(duì)A549細(xì)胞遷移的抑制率由(7.02±8.64)%提高至(38.86±7.69)%(P0.01)。HPLC結(jié)果顯示:經(jīng)化學(xué)修飾,12h后多肽RKRKRKKSRYIVLS在血清中的剩余量由(70.52±1.55)%提高至(77.90±1.19)%(P0.01),24h后在血清中的剩余量由(56.04±1.81)%提高至(64.64±0.30)%(P0.01)。多肽QKRKRKKSRKKH化學(xué)修飾前后在10%血清環(huán)境下對(duì)A549細(xì)胞增殖的抑制率分別為(28.38±5.63)%、(34.25±10.90)%(P0.05);細(xì)胞活力的抑制率分別為(8.09±5.84)%、(15.07±8.09)%(P0.05);修飾后對(duì)A549細(xì)胞遷移的抑制率由(28.27±3.79)%提高至(66.78±4.43)%(P0.01)。HPLC結(jié)果顯示:經(jīng)化學(xué)修飾,12h后多肽QKRKRKKSRKKH在血清中的剩余量由(80.14±1.81)%提高至(82.46±0.84)%(P0.05),24h后在血清中的剩余量由(72.72±2.60)%提高至(77.43%±1.78)%(P0.05)。2.構(gòu)建了原核表達(dá)載體p GEX4T-1-多肽,成功誘導(dǎo)表達(dá)并獲得純化的GST-多肽融合蛋白,免疫共沉淀證實(shí)VEGFR的2個(gè)亞型(VEGFR-1、VEGFR-2)均為多肽探針QKRKRKKSRKKH、RKRKRKKSRYIVLS的作用位點(diǎn)。3.Western Blot結(jié)果顯示:多肽QKRKRKKSRKKH、RKRKRKKSRYIV LS對(duì)A549細(xì)胞中VEGFR-1和VEGFR-2的磷酸化水平未見(jiàn)明顯影響。4.si RNA技術(shù)成功沉默VEGF的表達(dá),CCK-8實(shí)驗(yàn)證實(shí)細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中無(wú)內(nèi)、外源性VEGF時(shí),這2條多肽仍能抑制A549細(xì)胞的增殖。5.生物信息學(xué)理論上預(yù)測(cè)多肽的候選受體包括:EGFR、Tie-2R、HGFR、VIPR-2、FLT-3、αvβ3;體外受體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合實(shí)驗(yàn)表明多肽不能與EGFR結(jié)合。免疫共沉淀結(jié)果顯示:多肽不能結(jié)合VIPR-2,但可以與Tie-2R、HGFR結(jié)合。結(jié)論1.對(duì)多肽進(jìn)行保護(hù)性化學(xué)修飾后其在10%血清環(huán)境下的穩(wěn)定性明顯提高,其中RKRKRKKSRYIVLS的提高更為明顯。2.成功誘導(dǎo)表達(dá)、純化GST-多肽融合蛋白,免疫共沉淀證實(shí)VEGFR的2個(gè)亞型即VEGFR-1和VEGFR-2均是多肽的作用靶點(diǎn)。3.多肽對(duì)A549細(xì)胞增殖的抑制效應(yīng)可能不是通過(guò)影響VEGFR-1和VEGFR-2的磷酸化水平而引起。初步實(shí)驗(yàn)表明多肽QKRKRKKSRKKH、RKRKRKKSRYIVLS具有多靶點(diǎn),除VEGFR-1及VEGFR-2外,HGFR、TIE-2R也是其作用靶點(diǎn)。
【關(guān)鍵詞】：多肽 分子探針 腫瘤靶向 受體 血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R730.4
【目錄】：

• 縮略語(yǔ)表4-6
• 英文摘要6-9
• 中文摘要9-12
• 第一章 前言12-14
• 第二章 腫瘤分子探針的化學(xué)修飾14-27
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料14-15
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法15-18
• 2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果18-25
• 2.4 討論25-27
• 第三章 腫瘤分子探針作用靶點(diǎn)的初步鑒定27-50
• 3.1 實(shí)驗(yàn)材料27-29
• 3.2 實(shí)驗(yàn)方法29-35
• 3.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果35-47
• 3.4 討論47-50
• 全文結(jié)論50-51
• 參考文獻(xiàn)51-54
• 文獻(xiàn)綜述 VEGF/VEGFRs與腫瘤的抗血管生成治療及腫瘤核素顯像54-69
• 參考文獻(xiàn)64-69
• 攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的論文69-70
• 致謝70

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本文編號(hào)：516734