本文關鍵詞：ONYX-015與Nutlin-3a對惡性間皮瘤細胞的作用研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的:惡性間皮瘤(Malignant mesothelioma),通常也稱為彌漫性惡性間皮瘤�，F(xiàn)今,惡心間皮瘤的發(fā)病原因及機制仍不十分清楚,但幾乎與所有種類的石棉類物質的過多暴露呈直接相關。隨著1970年以來,尤其是工業(yè)化國家和發(fā)展中國家,石棉類物質的生產消費增加,惡性間皮瘤患者不斷增加。這種疾病潛伏期可以長度超過30年。預計未來的幾十年中,惡性間皮瘤的患者數(shù)量仍將持續(xù)增長。可是如今,還沒有非常行之有效的預防措施。當下對于腫瘤的治療方式繁多,但是惡性間皮瘤仍然是難以治療的。惡性間皮瘤中胸膜間皮瘤約占75%,惡性腹膜間皮瘤排名緊隨其后。惡性間皮瘤的早期典型臨床癥狀和體征缺乏特異性,極易誤診、漏診,檢出率低。惡性間皮瘤快速的在胸膜腔或者腹膜腔生長、浸潤,手術治療只適合早期病患,即使進行胸膜切除根治術后,復發(fā)率也非常高。惡性間皮瘤對于放射性治療并不敏感,所以只在部分姑息治療的病例中使用。因此,化學療法受到廣泛的認同,全身化療是現(xiàn)行主要的治療方法,順鉑(CDDP)和培美曲塞(PEM)是當前一線化療方案,但是治療后中位生存期不足一年。所以,迫切需要一個新的基于惡性間皮瘤的分子機制的治療策略,對于延長患者生存期和提高生活質量是十分必要的。惡性間皮瘤大多含有存在野生型p53基因,但是p53蛋白表達功能受到限制,不能誘導細胞進入凋亡通路。主要是因為p16基因INK4A位點,以及p14基因ARF位點存在基因缺陷,由此無法完成p53介導的細胞凋亡。ONYX-015是一種選擇性增殖腺病毒,具有優(yōu)越的選擇特異性能力,在正常細胞中低量增殖甚至不增殖,而在腫瘤細胞中大量增殖。同時,ONYX-015還可以完善腫瘤細胞內的p53通路,激活p53信號通路,從而表達p53蛋白誘導細胞凋亡。Nutlin-3a是高度特異性的MDM2(murine double minute2)蛋白小分子抑制劑,可以通過與MDM2結合,抑制MDM2蛋白功能,打斷MDM2-p53環(huán),通過抑制蛋白酶體功能減少p53降解。80%以上的p53蛋白的降解通過蛋白酶體,當?shù)鞍酌阁w受到抑制,p53蛋白通過堆積使細胞進入凋亡。本研究通過ONYX-015與Nutlin-3a在間質瘤細胞中的作用效果,ONYX-015表達p53基因,Nutlin-3a減少p53降解,檢測ONYX-015和Nutlin-3a的抗腫瘤效果,抑制細胞生長能力。結果顯示,ONYX-015提高p53表達水平,促進p53磷酸化,同時,Nutlin-3a特異性的與惡性間皮瘤中MDM2蛋白的結合,蛋白酶體功能受到抑制,p53降解減少,導致p53蛋白堆積,同時p21表達升高并且磷酸化Rb的表達降低,細胞凋亡蛋白酶3(cleaved caspase-3)和細胞凋亡蛋白酶8(cleaved caspase-8)表達升高,激活p53介導的外源性凋亡信號傳導通路。方法:本實驗使用體外培養(yǎng)惡性間皮瘤:MSTO-211H,NCI-H28,EHMES-10,NCI-H2052,EHMES-1,NCI-2452及JMN-1B細胞株。以MTT實驗,通過MTT結果計算50%抑制藥物濃度值(IC50),判斷對數(shù)生長期細胞對選擇性腺病毒(選用ONYX-015)及MDM2蛋白抑制劑(選用Nutlin-3a)在以上惡性間皮瘤細胞系的抑制敏感性。并使用Trypan blue dye exclusion assay檢測ONYX-015對以上惡性間皮瘤細胞系的細胞生長的抑制效果。通過流式細胞技術檢測細胞周期,分析ONYX-015對Sub-G1期為主的細胞周期的影響。使用Western blot方法分析ONYX-015及Nutlin-3a使用所導致細胞凋亡的傳導通路變化。最后,運用細胞活性實驗來檢測,ONYX-015和Nutlin-3a聯(lián)合用藥相比于單獨用藥的藥效區(qū)別,將產生協(xié)同作用還是拮抗作用。β-半乳糖苷酶轉基因腺病毒(Ad/Lac Z)作為細胞毒性低的腺病毒,在實驗過程中作為陰性對照。結果:1 MTT的分析結果人體惡性間皮瘤細胞系:MSTO-211H,NCI-H28,EHMES-10,NCI-H2052,EHMES-1,NCI-2452及JMN-1B經過不同濃度的ONYX-015和處理對細胞活性的影響,Ad-Lac Z作為陰性對照。CI50結果顯示MSTO-211H、NCI-H28、NCI-H2052、EHMES-10細胞較為敏感。同時結果提示MSTO-211H細胞對ONYX-015最為敏感,其次是NCI-H28、EHMES-10細胞對ONYX-015較為敏感。之后是NCI-H2052細胞,而EHMES-1,NCI-2452及JMN-1B細胞對ONYX-015不敏感。原因為EHMES-1,NCI-2452及JMN-1B為變異性p53細胞株,MSTO-211H、NCI-H28、NCI-H2052、EHMES-10為野生型p53細胞株。說明變異型p53細胞系普遍對ONYX-015不敏感。野生型p53細胞MSTO-211H、NCI-H28、NCI-H2052、EHMES-10經過Nutlin-3a處理,MSTO-211H、NCI-H28、EHMES-10細胞較為敏感,Nutlin-3a抑制了MSTO-211H、NCI-H28細胞的惡性間皮瘤細胞的生長。根據(jù)MTT計算的IC50結果提示NCI-H28細胞對Nutlin-3a最為敏感,其次是MSTO-211H細胞,之后是EHMES-10細胞,NCI-H2052細胞對Nutlin-3a敏感性不佳。2臺盼藍染色檢測(Trypan blue dye exclusion assay)Trypan blue dye exclusion assay結果顯示:ONYX-015抑制了MSTO-211H、NCI-H28細胞的惡性間皮瘤細胞的生長。而Ad/Lac Z對照組生長情況與空白對照組類似,未受到明顯抑制。3流式細胞周期的分析結果分別使用ONYX-015和Ad/Lac Z感染惡性間皮瘤細胞NCI-H28和MSTO-211H,Ad/Lac Z作為陰性對照。ONYX-015導致NCI-H28細胞周期sub-G1期明顯比例提升,以及細胞周期G2/M期比例提升,S期和G0/G1期比例減低。MSTO-211H細胞表現(xiàn)為Sub-G1比例,以及G0/G1期比例提升,G2/M期與S期比例變化幅度不明顯。兩種細胞對比,NCI-H28細胞與MSTO-211H細胞Sub-G1的比例相比,NCI-H28細胞的Sub-G1增加的更加明顯,說明NCI-H28細胞對ONYX-015更加敏感性。同時,陰性對照Ad/Lac Z組的結果與空白對照組不存在明顯差異。4蛋白質印跡法(Western blot)的分析結果4.1使用Western blot分析檢測ONYX-015在MSTO-211H和NCI-H28細胞介導p53的分子信號通路。p53蛋白及下游產物升高,磷酸化Rb降低。4.2在MSTO-211H和NIC-H28兩個細胞中,ONYX-015處理后沒有誘導caspase-9的剪切,但誘發(fā)了caspase-3和caspase-8的剪切。以上結果表明p53介導的外源性凋亡通路的信號傳導通路被ONYX-015激活。5 MTT分析ONYX-015與Nutlin-3a的聯(lián)合作用對人體惡性間皮瘤NCI-H28和MSTO-211H細胞進行不同濃度的ONYX-015與Nutlin-3a作用后,選擇適當?shù)穆?lián)合藥物濃度進行試驗,再進行英國劍橋開發(fā)的Calcu Syn軟件分析后聯(lián)合用藥指數(shù)CI顯示:ONYX-015與Nutlin-3a聯(lián)合藥物應用對惡性間皮瘤細胞產生協(xié)同的抑制作用。結論:1 ONYX-015有效抑制了野生型p53的惡性間皮瘤細胞的生長。2 ONYX-015導致惡性間皮瘤細胞凋亡。3 ONYX-015使p53介導的外源性分子信號傳導通路完成表達,提高p53及下游產物表達水平。4 Nutlin-3a有效抑制了惡性間皮瘤細胞的增殖,介導細胞凋亡。5 ONYX-015和Nutlin-3a聯(lián)合藥物應用對惡性間皮瘤細胞產生協(xié)同的抑制效果。
【關鍵詞】：惡性間皮瘤 ONYX-015 MDM2蛋白抑制劑 Nutlin-3a 化學治療
【學位授予單位】：河北醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R73-36
【目錄】：

• 摘要4-8
• 英文摘要8-13
• 英文縮寫13-15
• 前言15-18
• 材料與方法18-22
• 結果22-24
• 附圖24-31
• 討論31-36
• 結論36-37
• 參考文獻37-43
• 綜述 惡性間皮瘤的治療前景43-53
• 參考文獻48-53
• 致謝53-54
• 個人簡歷54

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 劉都戶;劉文超;范黎;盛蓉;薛妍;王微;王錦;黃穎;;今又生聯(lián)合熱療治療漿膜腔惡性積液近期療效[J];中華腫瘤防治雜志;2006年14期

2 鄔黎青;詹媛;王莉;陳玲;陳小青;楊洋;高歌;郝華;;Nutlin-3a誘導p73α對p53突變型結腸癌細胞的作用及其機制研究[J];中國全科醫(yī)學;2014年36期

  本文關鍵詞：ONYX-015與Nutlin-3a對惡性間皮瘤細胞的作用研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號：508365