本文關(guān)鍵詞：人食管鱗癌紫杉醇耐藥細(xì)胞株的建立及其干細(xì)胞特性的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：背景食管癌的全球發(fā)病率在惡性腫瘤中位居第8位,死亡率位居惡性腫瘤第6位。食管癌的最常見組織學(xué)類型是食管鱗狀細(xì)胞癌。紫杉醇具有廣泛的抗腫瘤活性,被廣泛應(yīng)用于治療各種惡性腫瘤。然而,原發(fā)性或獲得性耐藥嚴(yán)重限制了紫杉醇的治療潛力。紫杉醇的耐藥機(jī)制目前尚不明確,進(jìn)一步了解化療過程中腫瘤細(xì)胞耐藥的分子機(jī)制可能會發(fā)現(xiàn)新型治療靶點(diǎn)并獲得更佳化療效果。多種腫瘤的腫瘤干細(xì)胞已被證明與腫瘤的發(fā)生、復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移和耐藥密切相關(guān)。盡管一些研究證明了食管腫瘤干細(xì)胞的存在,但食管腫瘤干細(xì)胞的作用仍存在爭論,且少有文獻(xiàn)研究對紫杉醇耐藥的食管鱗癌細(xì)胞是否具有腫瘤干細(xì)胞的特性。目的建立人食管鱗癌紫杉醇耐藥細(xì)胞株,探究人食管鱗癌紫杉醇耐藥細(xì)胞是否具有腫瘤干細(xì)胞的特性。研究對象人食管鱗癌細(xì)胞株EC109購自中科院上海細(xì)胞庫第一部分人食管鱗癌紫杉醇耐藥細(xì)胞株的建立方法對人食管鱗癌細(xì)胞株EC109細(xì)胞進(jìn)行復(fù)蘇、傳代和凍存,以紫杉醇為誘導(dǎo)藥物,通過高劑量間歇誘導(dǎo)+時間遞增的方式誘導(dǎo)出人食管鱗癌紫杉醇耐藥細(xì)胞株R-EC109。然后采用MTT法檢測紫杉醇耐藥細(xì)胞R-EC109的耐藥穩(wěn)定性。結(jié)果歷時7m,誘導(dǎo)出人食管鱗癌紫杉醇耐藥細(xì)胞株R-EC109。MTT法檢測耐藥細(xì)胞株耐藥穩(wěn)定性,顯示親本細(xì)胞EC109半數(shù)抑制濃度(IC50)為0.068±0.003μg/m L,而耐藥細(xì)胞R-EC109 IC50為3.578±0.089μg/m L(P0.001),兩者差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。耐藥細(xì)胞R-EC109對紫杉醇耐藥指數(shù)(RI)為67.258,屬于高度耐藥。在誘導(dǎo)結(jié)束30d、60d、90d、120d后再分別用MTT法檢測耐藥細(xì)胞R-EC109耐藥穩(wěn)定性,結(jié)果示其耐藥指數(shù)維持在67左右,顯示耐藥細(xì)胞R-EC109的耐藥穩(wěn)定性良好。小結(jié)成功誘導(dǎo)出了高度耐藥的、穩(wěn)定性良好的人食管鱗癌紫杉醇耐藥細(xì)胞株R-EC109。第二部分人食管鱗癌細(xì)胞EC109和耐藥細(xì)胞R-EC109的生物學(xué)對比鑒定方法取耐藥細(xì)胞R-EC109和親本細(xì)胞EC109分別進(jìn)行培養(yǎng),第三代以后用于實(shí)驗(yàn)。1.成球?qū)嶒?yàn)取對數(shù)生長期的耐藥細(xì)胞R-EC109和親本細(xì)胞EC109,以每孔5000個細(xì)胞接種于超低粘附6孔板中,每2d換半量的成球?qū)嶒?yàn)培養(yǎng)液。10d后,觀察并計數(shù)耐藥細(xì)胞R-EC109和親本細(xì)胞EC109的成球情況。計數(shù)20個細(xì)胞的細(xì)胞球數(shù)目。2.克隆性細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)以每瓶(細(xì)胞培養(yǎng)瓶面積25cm2)600個耐藥細(xì)胞R-EC109或親本細(xì)胞EC109的數(shù)量分別接種到細(xì)胞培養(yǎng)瓶中進(jìn)行培養(yǎng),每24h觀察細(xì)胞生長情況,每2-3d更換培養(yǎng)液。10d后棄去培養(yǎng)液,100%甲醇固定細(xì)胞,0.5%結(jié)晶紫染色貼壁細(xì)胞,5min后棄去結(jié)晶紫及多余溶液。計數(shù)50個細(xì)胞的克隆個數(shù)。3.干性基因m RNA表達(dá)的鑒定取耐藥細(xì)胞R-EC109和親本細(xì)胞EC109分別加入裂解液,提取各自的總RNA,測定RNA濃度,鑒定RNA純度,檢測RNA完整性,然后進(jìn)行干性基因m RNA反轉(zhuǎn)錄,最后進(jìn)行定量PCR反應(yīng)檢測干性基因m RNA表達(dá)情況。4.側(cè)群分選0.25%胰蛋白酶分別消化耐藥細(xì)胞R-EC109和親本細(xì)胞EC109,收集細(xì)胞,用RPMI1640(含HEPES)稀釋細(xì)胞。將耐藥細(xì)胞R-EC109和親本細(xì)胞EC109各分為兩組,實(shí)驗(yàn)組:加入維拉帕米液及Hoechst33342熒光染料;對照組:加入Hoechst33342熒光染料。用錫紙包裹,避光37℃水浴,孵育90min,然后收集細(xì)胞,用400目濾網(wǎng)過濾,立即用流式細(xì)胞儀分析各組中SP細(xì)胞含量。先進(jìn)行散射光分析,去除細(xì)胞碎片,以形態(tài)良好的細(xì)胞群體為目標(biāo)細(xì)胞。然后進(jìn)行Hoechst33342雙參數(shù)分析,以紅光為X軸,以藍(lán)光為Y軸。在已有圖中設(shè)立活細(xì)胞門,用加入維拉帕米液的對照來確定側(cè)群細(xì)胞位置。5.腫瘤浸潤轉(zhuǎn)移基因m RNA表達(dá)的鑒定分別提取耐藥細(xì)胞R-EC109和親本細(xì)胞EC109的總RNA,測定RNA濃度,鑒定RNA純度,檢測RNA完整性,然后進(jìn)行m RNA反轉(zhuǎn)錄,最后通過定量PCR反應(yīng)得出腫瘤浸潤轉(zhuǎn)移基因m RNA表達(dá)情況。結(jié)果1.耐藥細(xì)胞R-EC109的成球率(13.2±2.1%)高于親本細(xì)胞EC109的成球率(7.6±1.7%)(P0.01),具有較強(qiáng)自我更新能力。2.耐藥細(xì)胞R-EC109的克隆形成能力(65.2±4.1%)高于親本細(xì)胞EC109的克隆形成能力(36.8±3.9%)(P0.05)。3.耐藥細(xì)胞R-EC109中干性基因Bmi-1(3.3544±0.4570)、Nanog(2.5657±0.2677)、Oct4(3.5767±0.3754)、Sox2(1.6788±0.1688)、ABCG2(2.8655±0.1700)、Nestin(3.1567±0.5879)和Ki-67(4.1678±0.5967)的表達(dá)高于親本細(xì)胞EC109中干性基因Bmi-1(1±0.1468)、Nanog(1±0.0875)、Oct4(1±0.0976)、Sox2(1±0.1132)、ABCG2(1±0.0645)、Nestin(1±0.1670)和Ki-67(1±0.0746)的表達(dá)(P值均0.05)。4.耐藥細(xì)胞R-EC109中SP側(cè)群細(xì)胞含量(5.8%)高于親本細(xì)胞EC109中SP側(cè)群細(xì)胞含量(2.3%)(P0.05)。5.耐藥細(xì)胞R-EC109中E-cadherin基因(0.6245±0.0598)的表達(dá)低于EC109細(xì)胞中E-cadherin基因(1±0.0479)的表達(dá),而耐藥細(xì)胞R-EC109中基因N-cadhe rin(2.5882±0.1330)、Snail(2.4767±0.0798)和Twist(2.8563±0.0797)的表達(dá)高于親本細(xì)胞EC109中基因N-cadherin(1±0.0743)、Snail(1±0.0579)和Twi st(1±0.0780)的表達(dá)(P值均0.05),耐藥細(xì)胞R-EC109的EMT過程更活躍。小結(jié)耐藥細(xì)胞R-EC109具有腫瘤干細(xì)胞多重特性。其成球能力、克隆形成能力、干性基因m RNA的表達(dá)、SP側(cè)群細(xì)胞含量均高于親本細(xì)胞EC109,且其具有更強(qiáng)的轉(zhuǎn)移侵襲能力,EMT過程更活躍。結(jié)論1.建立的人食管鱗癌紫杉醇耐藥細(xì)胞株R-EC109具有腫瘤干細(xì)胞多重特性。2.腫瘤干細(xì)胞可能是R-EC109細(xì)胞對紫杉醇耐藥的根本原因之一。
【關(guān)鍵詞】：食管鱗狀細(xì)胞癌 腫瘤干細(xì)胞 腫瘤啟動細(xì)胞 紫杉醇 耐藥
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R735.1
【目錄】：

• 中文摘要4-8
• Abstract8-13
• 中英文縮略詞對照表13-14
• 前言14-18
• 第一部分 人食管鱗癌紫杉醇耐藥細(xì)胞株的建立18-25
• 1 實(shí)驗(yàn)材料與方法18-22
• 2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果22-23
• 3 討論23-24
• 4 小結(jié)24-25
• 第二部分 人食管鱗癌細(xì)胞EC109 和耐藥細(xì)胞R-EC109 的生物學(xué)對比鑒定25-42
• 1 實(shí)驗(yàn)材料與方法25-33
• 2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果33-38
• 3 討論38-41
• 4 小結(jié)41-42
• 結(jié)論42-43
• 參考文獻(xiàn)43-49
• 綜述 食管鱗癌干細(xì)胞及其耐藥機(jī)制的研究進(jìn)展49-61
• 參考文獻(xiàn)56-61
• 個人簡歷、在校期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文61-62
• 致謝62-63

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  本文關(guān)鍵詞：人食管鱗癌紫杉醇耐藥細(xì)胞株的建立及其干細(xì)胞特性的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號：502283