本文關(guān)鍵詞：靶向癌胚抗原的嵌合受體的構(gòu)建及初步應(yīng)用，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：背景與目的過(guò)繼細(xì)胞治療(adoptive cell therapy,ACT)是指自體免疫細(xì)胞進(jìn)行體外大量擴(kuò)增,然后將其回輸至腫瘤患者體內(nèi)。因其副作用小,安全性高,可去除腫瘤患者體內(nèi)微小殘留灶等優(yōu)點(diǎn)。目前臨床上廣泛使用的是非特異性的過(guò)繼細(xì)胞治療,如淋巴因子活化的殺傷細(xì)胞(lymphokine activated killer cell,LAK)、腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞(tumor infiltrating lymphocytes,TILs)、細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞(cytokine induced killer cell,CIK)等。由于這些細(xì)胞并非經(jīng)過(guò)腫瘤特異性篩選,其TCR識(shí)別腫瘤抗原具有隨機(jī)性,且腫瘤細(xì)胞通常下調(diào)MHC分子,從而抑制T細(xì)胞對(duì)腫瘤抗原識(shí)別和殺傷。嵌合抗原受體(chimeric antigen receptors,CARs)由抗原識(shí)別域、鉸鏈區(qū)、跨膜區(qū)和胞內(nèi)信號(hào)域依次連接組成,抗原識(shí)別域即sc Fv(single chain variable fragment),由腫瘤特異性單克隆抗體的輕鏈(VL)和重鏈(VH)結(jié)構(gòu)域連接構(gòu)成;胞內(nèi)信號(hào)域通常為CD3ζ鏈或FcRγ,或與一種或多種共刺激分子相連,如OX-40/CD134,CD137/4-1BB,CD28等。腫瘤細(xì)胞表面的抗原(配體)與嵌合抗原受體的抗體(受體)結(jié)合時(shí),通過(guò)鉸鏈區(qū)和跨膜區(qū)將信號(hào)傳遞至胞內(nèi),胞內(nèi)信號(hào)域?qū)⑿盘?hào)轉(zhuǎn)化為活化信號(hào),激活效應(yīng)細(xì)胞,效應(yīng)細(xì)胞增殖、產(chǎn)生多種細(xì)胞因子如TNF-α、IFN-γ、穿孔素、顆粒酶等從而殺傷腫瘤細(xì)胞。其具有以下優(yōu)勢(shì):特異性:○1抗體(受體)特異性識(shí)別抗原(配體);○2 MHC非限制性:不需要與MHC-Ⅰ分子結(jié)合,并且可克服腫瘤細(xì)胞不表達(dá)或低表達(dá)腫瘤抗原及腫瘤微環(huán)境下調(diào)MHC-Ⅰ分子造成的免疫逃逸;○3不會(huì)出現(xiàn)轉(zhuǎn)基因TCR與患者內(nèi)源性TCR發(fā)生錯(cuò)配的情況;○4抗原來(lái)源廣,可以是糖類、脂類、蛋白質(zhì)。癌胚抗原(carcinoembryonic antigen,CEA)是一種糖蛋白,在60-94%轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)結(jié)直腸癌中高表達(dá),廣泛應(yīng)用于結(jié)直腸癌臨床輔助診斷、預(yù)后及復(fù)發(fā)監(jiān)測(cè)指標(biāo)。因此在已有研究基礎(chǔ)上本研究利用分子克隆技術(shù)構(gòu)建了以抗CEA單鏈抗體為嵌合抗原受體的慢病毒載體LV-EF1α-sc Fv(CEA)-CD3-2A-GFP-WPRE,其胞內(nèi)信號(hào)為CD3ζ鏈。通過(guò)慢病毒包裝,感染人T細(xì)胞,探討該嵌合抗原受體在T細(xì)胞中的表達(dá)情況及對(duì)結(jié)直腸癌CEA陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞系的殺傷作用。為后續(xù)研究及應(yīng)用嵌合抗原受體修飾T細(xì)胞治療結(jié)直腸癌奠定基礎(chǔ)。方法1.分子克隆技術(shù)構(gòu)建慢病毒載體LV-EF1α-scFv(CEA)-2A-GFP-WPRE。2.磷酸鈣法包裝慢病毒。3.慢病毒感染人外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMC)細(xì)胞。4.流式細(xì)胞術(shù)和非變性非還原Western blot檢測(cè)sc Fv(CEA)-CAR在T淋巴細(xì)胞中的表達(dá)。5.體外實(shí)驗(yàn)檢測(cè)CAR修飾T細(xì)胞對(duì)結(jié)直腸癌CEA陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞系,CEA陰性腫瘤細(xì)胞殺傷作用。結(jié)果1.經(jīng)PCR擴(kuò)增、酶切、連接等常規(guī)分子克隆技術(shù)及核苷酸序列檢測(cè),證實(shí)成功構(gòu)建慢病毒載體LV-EF1α-sc Fv(CEA)-2A-GFP-WPRE。2.磷酸鈣法包裝慢病毒,經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)測(cè)得病毒滴度為3×107TU/ml。3.以10MOI慢病毒感染外周血單個(gè)核細(xì)胞,經(jīng)過(guò)14天的培養(yǎng),熒光顯微鏡下觀察到感染后T細(xì)胞呈典型聚集生長(zhǎng)型態(tài),且細(xì)胞表達(dá)GFP熒光,表明慢病毒成功感染T細(xì)胞。4.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)scFv(CEA)-CAR在感染后T細(xì)胞的表達(dá)率為62.8%,非變性非還原Western blot證實(shí)感染后的T細(xì)胞可正確表達(dá)抗CEA抗體。5.CAR修飾T細(xì)胞對(duì)結(jié)直腸癌CEA陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞系有特異性的殺傷作用,CEA陰性的腫瘤細(xì)胞系幾乎無(wú)殺傷作用。結(jié)論嵌合抗原受體可在T細(xì)胞中正確表達(dá),對(duì)結(jié)直腸癌CEA陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞系有特異性殺傷作用。為后續(xù)體內(nèi)研究及應(yīng)用嵌合抗原受體修飾T細(xì)胞治療結(jié)直腸癌打下堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：結(jié)直腸癌 嵌合抗原受體 癌胚抗原 T淋巴細(xì)胞 慢病毒 免疫治療
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R735.34
【目錄】：

• 縮略語(yǔ)表4-6
• Abstract6-9
• 中文摘要9-11
• 第一章 前言11-13
• 第二章 構(gòu)建慢病毒載體LV-EF1α-sc Fv（CEA）-2A-GFP-WPRE13-25
• 2.1 材料13-17
• 2.2 方法17-22
• 2.3 結(jié)果22-24
• 2.4 討論24-25
• 第三章 靶向癌胚抗原的嵌合受體的初步應(yīng)用25-40
• 3.1 材料25-29
• 3.2 方法29-35
• 3.3 結(jié)果35-38
• 3.4 討論38-40
• 全文結(jié)論40-41
• 參考文獻(xiàn)41-48
• 文獻(xiàn)綜述 嵌合抗原受體修飾免疫細(xì)胞治療技術(shù)研究進(jìn)展48-61
• 參考文獻(xiàn)54-61
• 攻讀學(xué)位期間的研究成果61-62
• 致謝62

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本文編號(hào)：498820