本文關鍵詞：靶向癌胚抗原的嵌合受體的構建及初步應用，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：背景與目的過繼細胞治療(adoptive cell therapy,ACT)是指自體免疫細胞進行體外大量擴增,然后將其回輸至腫瘤患者體內。因其副作用小,安全性高,可去除腫瘤患者體內微小殘留灶等優(yōu)點。目前臨床上廣泛使用的是非特異性的過繼細胞治療,如淋巴因子活化的殺傷細胞(lymphokine activated killer cell,LAK)、腫瘤浸潤淋巴細胞(tumor infiltrating lymphocytes,TILs)、細胞因子誘導的殺傷細胞(cytokine induced killer cell,CIK)等。由于這些細胞并非經過腫瘤特異性篩選,其TCR識別腫瘤抗原具有隨機性,且腫瘤細胞通常下調MHC分子,從而抑制T細胞對腫瘤抗原識別和殺傷。嵌合抗原受體(chimeric antigen receptors,CARs)由抗原識別域、鉸鏈區(qū)、跨膜區(qū)和胞內信號域依次連接組成,抗原識別域即sc Fv(single chain variable fragment),由腫瘤特異性單克隆抗體的輕鏈(VL)和重鏈(VH)結構域連接構成;胞內信號域通常為CD3ζ鏈或FcRγ,或與一種或多種共刺激分子相連,如OX-40/CD134,CD137/4-1BB,CD28等。腫瘤細胞表面的抗原(配體)與嵌合抗原受體的抗體(受體)結合時,通過鉸鏈區(qū)和跨膜區(qū)將信號傳遞至胞內,胞內信號域將信號轉化為活化信號,激活效應細胞,效應細胞增殖、產生多種細胞因子如TNF-α、IFN-γ、穿孔素、顆粒酶等從而殺傷腫瘤細胞。其具有以下優(yōu)勢:特異性:○1抗體(受體)特異性識別抗原(配體);○2 MHC非限制性:不需要與MHC-Ⅰ分子結合,并且可克服腫瘤細胞不表達或低表達腫瘤抗原及腫瘤微環(huán)境下調MHC-Ⅰ分子造成的免疫逃逸;○3不會出現(xiàn)轉基因TCR與患者內源性TCR發(fā)生錯配的情況;○4抗原來源廣,可以是糖類、脂類、蛋白質。癌胚抗原(carcinoembryonic antigen,CEA)是一種糖蛋白,在60-94%轉移、復發(fā)結直腸癌中高表達,廣泛應用于結直腸癌臨床輔助診斷、預后及復發(fā)監(jiān)測指標。因此在已有研究基礎上本研究利用分子克隆技術構建了以抗CEA單鏈抗體為嵌合抗原受體的慢病毒載體LV-EF1α-sc Fv(CEA)-CD3-2A-GFP-WPRE,其胞內信號為CD3ζ鏈。通過慢病毒包裝,感染人T細胞,探討該嵌合抗原受體在T細胞中的表達情況及對結直腸癌CEA陽性腫瘤細胞系的殺傷作用。為后續(xù)研究及應用嵌合抗原受體修飾T細胞治療結直腸癌奠定基礎。方法1.分子克隆技術構建慢病毒載體LV-EF1α-scFv(CEA)-2A-GFP-WPRE。2.磷酸鈣法包裝慢病毒。3.慢病毒感染人外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMC)細胞。4.流式細胞術和非變性非還原Western blot檢測sc Fv(CEA)-CAR在T淋巴細胞中的表達。5.體外實驗檢測CAR修飾T細胞對結直腸癌CEA陽性腫瘤細胞系,CEA陰性腫瘤細胞殺傷作用。結果1.經PCR擴增、酶切、連接等常規(guī)分子克隆技術及核苷酸序列檢測,證實成功構建慢病毒載體LV-EF1α-sc Fv(CEA)-2A-GFP-WPRE。2.磷酸鈣法包裝慢病毒,經流式細胞術測得病毒滴度為3×107TU/ml。3.以10MOI慢病毒感染外周血單個核細胞,經過14天的培養(yǎng),熒光顯微鏡下觀察到感染后T細胞呈典型聚集生長型態(tài),且細胞表達GFP熒光,表明慢病毒成功感染T細胞。4.流式細胞術檢測scFv(CEA)-CAR在感染后T細胞的表達率為62.8%,非變性非還原Western blot證實感染后的T細胞可正確表達抗CEA抗體。5.CAR修飾T細胞對結直腸癌CEA陽性腫瘤細胞系有特異性的殺傷作用,CEA陰性的腫瘤細胞系幾乎無殺傷作用。結論嵌合抗原受體可在T細胞中正確表達,對結直腸癌CEA陽性腫瘤細胞系有特異性殺傷作用。為后續(xù)體內研究及應用嵌合抗原受體修飾T細胞治療結直腸癌打下堅實的基礎。
【關鍵詞】：結直腸癌 嵌合抗原受體 癌胚抗原 T淋巴細胞 慢病毒 免疫治療
【學位授予單位】：第三軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R735.34
【目錄】：

• 縮略語表4-6
• Abstract6-9
• 中文摘要9-11
• 第一章 前言11-13
• 第二章 構建慢病毒載體LV-EF1α-sc Fv（CEA）-2A-GFP-WPRE13-25
• 2.1 材料13-17
• 2.2 方法17-22
• 2.3 結果22-24
• 2.4 討論24-25
• 第三章 靶向癌胚抗原的嵌合受體的初步應用25-40
• 3.1 材料25-29
• 3.2 方法29-35
• 3.3 結果35-38
• 3.4 討論38-40
• 全文結論40-41
• 參考文獻41-48
• 文獻綜述 嵌合抗原受體修飾免疫細胞治療技術研究進展48-61
• 參考文獻54-61
• 攻讀學位期間的研究成果61-62
• 致謝62

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  本文關鍵詞：靶向癌胚抗原的嵌合受體的構建及初步應用，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：498820