本文關(guān)鍵詞：BTG2對(duì)膀胱癌細(xì)胞EJ生物學(xué)特性的影響，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的：為了研究抗增殖蛋白BTG2 (B cell translocation gene 2,BTG2)在膀胱癌發(fā)生發(fā)展中的作用,本課題首先采用RT-PCR的方法測(cè)定不同膀胱癌細(xì)胞株EJ、BIU-87、5637、T24及正常的人膀胱上皮永生化細(xì)胞SV-HUC-1中BTG2的表達(dá),分析人膀胱上皮永生化細(xì)胞中BTG2的表達(dá)與膀胱癌細(xì)胞中表達(dá)的差異。構(gòu)建人BTG2真核表達(dá)載體pcDNA3. 1(+)-BTG2,篩選并鑒定膀胱癌EJ細(xì)胞穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株,觀察BTG2對(duì)膀胱癌細(xì)胞EJ形態(tài)、生長(zhǎng)、克隆形成、遷移的影響,在細(xì)胞水平初步探討B(tài)TG2在膀胱癌發(fā)生發(fā)展中的作用,為未來(lái)膀胱癌基因治療提供理論依據(jù)。方法：比較BTG2在不同膀胱癌細(xì)胞株中的表達(dá)：用含有10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)膀胱癌細(xì)胞EJ、BIU-87、T24、5637,用含10%胎牛血清的F12K培養(yǎng)基培養(yǎng)人膀胱上皮永生化細(xì)胞SV-HUC-1,用TRIzol提取細(xì)胞總RNA后利用RT-PCR的方法測(cè)定不同細(xì)胞中BTG2的表達(dá),分析膀胱癌細(xì)胞中BTG2的表達(dá)量與人膀胱上皮永生化細(xì)胞SV-HUC-1中表達(dá)量的不同,判斷細(xì)胞中BTG2表達(dá)是否在正常細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞中存在顯著性差異,闡明BTG2基因是否參與膀胱癌的發(fā)生和進(jìn)展。構(gòu)建了BTG2真核表達(dá)載體,并建立了膀胱癌EJ細(xì)胞穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株。首先根據(jù)人BTG2基因序列設(shè)計(jì)合適的引物,用PCR法得到BTG2片段,插入帶有真核細(xì)胞篩選標(biāo)記的pcDNA3.1(+)載體,構(gòu)建真核生物載體pcDNA3.1(+)-BTG2表達(dá)載體。采用限制性內(nèi)切酶及DNA測(cè)序?qū)χ亟M體進(jìn)行鑒定,證實(shí)載體構(gòu)建準(zhǔn)確無(wú)誤。然后將BTG2表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人膀胱癌細(xì)胞EJ,G418(400 mg/L)篩選出抗性克隆,擴(kuò)增后篩選出單克隆穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株。用G418(200 mg/L)維持培養(yǎng)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株,提取細(xì)胞總RNA(TRIzol),通過(guò)熒光定量PCR和半定量RT-PCR分析檢測(cè)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞中BTG2基因的表達(dá),證實(shí)BTG2在膀胱癌EJ細(xì)胞中有效表達(dá),最終成功建立了過(guò)表達(dá)BTG2的膀胱癌穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株。BTG2對(duì)膀胱癌細(xì)胞EJ生物學(xué)特性的影響：倒置顯微鏡下觀察BTG2對(duì)膀胱癌細(xì)胞EJ形態(tài)和數(shù)量的影響；應(yīng)用細(xì)胞生長(zhǎng)曲線法研究BTG2抗細(xì)胞增殖的作用；克隆形成實(shí)驗(yàn)計(jì)算克隆形成率,研究BTG2對(duì)膀胱癌細(xì)胞EJ增殖能力的影響；利用劃痕實(shí)驗(yàn)觀察BTG2對(duì)膀胱癌細(xì)胞EJ運(yùn)動(dòng)能力的影響。結(jié)果：利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法測(cè)定不同膀胱癌細(xì)胞及人膀胱上皮永生化細(xì)胞SV-HUC-1中BTG2 mRNA的量,數(shù)據(jù)顯示：人膀胱上皮永生化細(xì)胞SV-HUC-1中BTG2的表達(dá)明顯高于其他膀胱癌細(xì)胞EJ.BIU-87、T24、5637,而且在其余的膀胱腫瘤細(xì)胞中惡性度最高的T24細(xì)胞中BTG2的表達(dá)量最低,而細(xì)胞EJ和BIU-87則相近,惡性度較低的細(xì)胞5637中表達(dá)最高,據(jù)此發(fā)現(xiàn)膀胱癌惡性度越高BTG2的表達(dá)越低,可以推測(cè)BTG2在膀胱癌的發(fā)生發(fā)展中起抑癌作用。將構(gòu)建的pcDNA3.1(+)-BTG2表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到膀胱癌細(xì)胞EJ中,構(gòu)建穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株。觀察到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞B2C6較轉(zhuǎn)染空載體組E2C5細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢,細(xì)胞變寬,形態(tài)不規(guī)則,利用生長(zhǎng)曲線法測(cè)定BTG2對(duì)膀胱癌細(xì)胞EJ增殖的影響,轉(zhuǎn)染了BTG2的細(xì)胞較轉(zhuǎn)染空載體pc-DNA3.1(+)組及其未處理細(xì)胞EJ組細(xì)胞生長(zhǎng)明顯受到抑制。另外也發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染BTG2表達(dá)質(zhì)粒后細(xì)胞的生存能力受到顯著抑制,細(xì)胞克隆實(shí)驗(yàn)中觀察到轉(zhuǎn)染了BTG2的真核表達(dá)載體后細(xì)胞克隆明顯比轉(zhuǎn)染空載體和未處理組細(xì)胞克隆形成低并且克隆較小。此外,為了了解BTG2對(duì)膀胱癌細(xì)胞EJ運(yùn)動(dòng)能力的影響,劃痕實(shí)驗(yàn)的研究中發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染BTG2質(zhì)粒載體后膀胱癌細(xì)胞EJ的運(yùn)動(dòng)能力較未轉(zhuǎn)染組和轉(zhuǎn)染空載體組低,隨著時(shí)間的推移觀察到劃痕的面積縮小的程度較未處理組和轉(zhuǎn)染空載體組小,提示BTG2基因可以抑制膀胱癌細(xì)胞EJ的遷移,細(xì)胞遷移率明顯減小。結(jié)論：這些研究結(jié)果說(shuō)明,BTG2在膀胱癌細(xì)胞中的表達(dá)遠(yuǎn)較人膀胱上皮永生化細(xì)胞SV-HUC-1降低,提示BTG2的表達(dá)降低可能參與了膀胱癌的發(fā)生與發(fā)展,且BTG2能夠抑制膀胱癌細(xì)胞EJ的增殖能力并且減弱其遷移能力,可能在膀胱腫瘤中發(fā)揮抑癌基因的活性,為膀胱癌的診斷和治療提供了理論依據(jù)。
【關(guān)鍵詞】：膀胱癌 B細(xì)胞異位基因2 抗增殖 基因治療
【學(xué)位授予單位】：蘭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R737.14
【目錄】：

• 中文摘要3-5
• 英文摘要5-7
• 縮略詞表7-10
• 第一章 前言10-14
• 第二章 材料與方法14-26
• 2.1 主要材料與試劑14
• 2.2 主要溶液配制14-15
• 2.3 主要儀器15-16
• 2.4 細(xì)胞培養(yǎng)與處理16
• 2.4.1 細(xì)胞培養(yǎng)與傳代16
• 2.5 RT-PCR檢測(cè)不同膀胱癌細(xì)胞中BTG2的表達(dá)16-18
• 2.5.1 不同膀化癌細(xì)胞（EJ、T24、BIU-87、5的7)及人膀r郎掀び郎赴，
  
  本文編號(hào)：497521
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