本文關(guān)鍵詞：Genistein逆轉(zhuǎn)高危甲狀腺乳頭狀癌上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：Genistein是一種來源于豆類植物的異黃酮類化合物,結(jié)構(gòu)與雌二醇相似,主要與ER-β結(jié)合,介導(dǎo)雌激素樣作用,而ER與甲狀腺癌的發(fā)生具有重要關(guān)系。同時,Genistein還是一種酪氨酸蛋白激酶抑制劑,可抑制酪氨酸蛋白激酶TPK活性,導(dǎo)致癌細(xì)胞增殖受到抑制。臨床上,Genistein作為酪氨酸激酶抑制劑應(yīng)用在非小細(xì)胞肺癌、前列腺癌中,但是在甲狀腺癌中的作用鮮少報道。本研究通過不同濃度Genistein處理具有不同基因背景的甲狀腺癌細(xì)胞,探討Genistein對甲狀腺癌細(xì)胞,尤其是高危甲狀腺癌細(xì)胞的增殖及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)的作用,為高危甲狀腺癌的輔助治療提供實驗基礎(chǔ)和理論依據(jù)。第一部分Genistein在含有不同基因背景的甲狀腺癌細(xì)胞增殖中的研究方法1.培養(yǎng)人正常甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞Nthy-ori 3-1及含有不同基因背景的甲狀腺癌細(xì)胞BHP10-3(甲狀腺乳頭狀癌(papillary thyroid carcinoma, PTC), RET/PTC 1 rearrangement), BCPAP(PTC, BRAFv600Emutation), IHH4(PTC, BRAFv600Emutation), TT2609 (甲狀腺髓樣癌 (medullarythyroid carcinoma), MTC)。2.不同濃度(0,1%DMSO,2.5 μg/ml,5 μg/ml,10 μg/ml,20 μg/ml,40 μ g/ml,80 μg/ml)不同時間段(24h,48h,72h) Genistein處理甲狀腺癌細(xì)胞,以1%DMSO處理組作為對照,MTS檢測處理后細(xì)胞增殖情況。3.根據(jù)MTS結(jié)果,選取與3個時間段IC50值接近的值(0,5μg/ml,10 μg/ml,20μg/ml,40μg/ml)作為后續(xù)試驗濃度,首先鏡下觀察不同濃度處理后細(xì)胞形態(tài)變化,然后分別用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡情況,以及實時定量熒光PCR技術(shù)(RT-qPCR)、Western Blot檢測細(xì)胞周期蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果1.MTS檢測結(jié)果表明：Genistein邕夠有效抑制甲狀腺癌細(xì)胞的增殖,其中含有BRAFV600E突變的BCPAP和IHH4細(xì)胞株以及含有RET/PTC1重組的BHP10-3抑制率最高,達(dá)95-9996,而甲狀腺髓樣癌細(xì)胞的抑制率最高僅77%。同時Genistein也能夠抑制正常甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞的增殖,最高可達(dá)73%。所有細(xì)胞的MTS結(jié)果均呈明顯的時間依賴性和濃度依賴性。2.梯度濃度Genistein處理正常甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞及所有癌細(xì)胞后,鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化發(fā)現(xiàn)：正常細(xì)胞形態(tài)變化不明顯,細(xì)胞沒有出現(xiàn)明顯死亡現(xiàn)象；而各癌細(xì)胞株形態(tài)發(fā)生了明顯變化。其中細(xì)胞形態(tài)未經(jīng)任何處理為梭形的癌細(xì)胞BHPI0-3的體積逐漸變小,細(xì)胞突起回縮,細(xì)胞變圓變亮,細(xì)胞僅增殖受到抑制,并沒有出現(xiàn)明顯的細(xì)胞死亡；而最初為圓形的癌細(xì)胞BCPAP,IHH4體積逐漸增大,細(xì)胞處于崩解狀態(tài),出現(xiàn)明顯的細(xì)胞死亡；最初為圓形的癌細(xì)胞TT2609細(xì)胞呈現(xiàn)明顯的梭形改變,細(xì)胞突起逐漸增長,呈網(wǎng)狀改變,并出現(xiàn)明顯的細(xì)胞死亡。3.流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡結(jié)果表明：Genistein能夠誘導(dǎo)甲狀腺癌細(xì)胞的凋亡,而正常甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞沒有出現(xiàn)明顯的凋亡。其中含有RET/PTC1重組的BHP10-3細(xì)胞凋亡最高僅7.1%,含有BRApV600E突變的BCPAP高達(dá)25.3%,IHH4高達(dá)29.6%；甲狀腺髓樣癌細(xì)胞TT2609高達(dá)20.9%。4.流式細(xì)胞術(shù)檢查細(xì)胞周期表明：正常甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞及所有癌細(xì)胞周期均被阻滯在G2/M期,Genistein處理后正常細(xì)胞G2/M期升高約4倍,IHH4和BCPAP升高10倍、13倍,而BHP10-3和TT2609升高約8倍,具有明顯的統(tǒng)計學(xué)意義；正常細(xì)胞Nthy-ori 3-1的S期升高,其他癌細(xì)胞S期均降低,但都無統(tǒng)計學(xué)意義。5. RT-qPCR和Western Blot結(jié)果表明：所有癌細(xì)胞株的周期蛋白CyclinA2, CyclinBl降低,CyclinDl升高；而正常甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞上述三種周期蛋白均下降。結(jié)論1. Genistein抑制甲狀腺癌細(xì)胞增殖,呈明顯的時間依賴性和濃度依賴性。2. Genistein通過調(diào)控細(xì)胞周期蛋白CyclinA2, CyclinBl, CyclinDl將細(xì)胞周期阻滯在G2/M期,引起細(xì)胞凋亡,從而抑制癌細(xì)胞增殖。而對正常濾泡上皮細(xì)胞并沒有引起明顯的凋亡。即Genistein對含有BRAFV600E突變的高危甲狀腺癌細(xì)胞的抑制能力明顯高于不伴有BRAFV600E基因突變、而伴有RET/PTC1基因重排的PTC。第二部分Genistein在含有不同基因背景的甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化中的研究方法1.選擇含有不同基因背景的兩種甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞株,即BHP10-3 (RET/PTC1重組)和BCPAP(BRAFV600E突變),Western Blot檢測細(xì)胞上皮指標(biāo)E-cadherin和間葉指標(biāo)vimentin的基礎(chǔ)表達(dá)情況。2.不同濃度(0,5μg/ml,10μg/ml,20μg/ml,40μg/ml)的 Genistein處理兩種細(xì)胞后進(jìn)行RT-qPCR和Western Blot檢測EMT指標(biāo)(E-cadherin, vimentin, N-cadherin, snail);同時5 μg/ml的Genistein處理細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光檢測上訴指標(biāo)。3.選用低濃度5 μg/ml的Genistein處理細(xì)胞進(jìn)行劃痕實驗和transwell檢測細(xì)胞的遷移和浸潤能力。4.干擾掉β-catenin后transwell檢測細(xì)胞遷移和浸潤能力的變化,并在干擾掉β-catenin的基礎(chǔ)上用5 μg/ml的Genistein處理細(xì)胞觀察細(xì)胞遷移能力的改變。5.梯度Genistein處理后RT-qPCR和Western Blot檢測β-catenin總量的變化；分別提取核漿蛋白進(jìn)行Western Blot檢測β-catenin核漿定位的變化,并通過細(xì)胞免疫熒光進(jìn)一步驗證。結(jié)果1. Western Blot結(jié)果表明：BHP10-3和BCPAP細(xì)胞發(fā)生了上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化。2. RT-qPCR和Western Blot以及細(xì)胞免疫熒光結(jié)果表明：Genistein促進(jìn)上皮指標(biāo)E-cadherin的表達(dá),并抑制間葉指標(biāo)vimentin, N-cadherin和snail的表達(dá)。3.劃痕實驗及Transwell實驗結(jié)果表明：5 μ g/ml的Genistein,在未引起細(xì)胞死亡的情況下,抑制細(xì)胞的遷移和浸潤能力。4. RT-qPCR和Western Blot結(jié)果表明：Genistein處理后β-catenin表達(dá)水平升高；核漿蛋白Western Blot及細(xì)胞免疫熒光證實,β-catenin在細(xì)胞漿中的表達(dá)升高,在細(xì)胞核里的表達(dá)降低。5.干擾掉β-catenin后Genistein處理,細(xì)胞的遷移能力仍被明顯抑制。結(jié)論1. Genistein通過抑制wnt信號通路,減少β-catenin細(xì)胞核定位,增加其膜定位抑制甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化。2.除了抑制wnt信號通路以外,Genistein尚可抑制其他信號通路,比如MAPK通路。
【關(guān)鍵詞】：Genistein β-catenin 增殖 上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化 甲狀腺癌
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R736.1
【目錄】：

• 中文摘要6-10
• 英文摘要10-15
• 符號說明15-16
• 前言16-18
• 第一部分 Genistein在甲狀腺癌細(xì)胞增殖中的研究18-36
• 材料與方法18-30
• 結(jié)果30-35
• 小結(jié)35-36
• 第二部分 Genistein在甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化中的研究36-48
• 材料和方法36-40
• 結(jié)果40-47
• 小結(jié)47-48
• 討論48-51
• 結(jié)論51-52
• 參考文獻(xiàn)52-55
• 致謝55-56
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)位論文目錄56-58
• 學(xué)位論文評閱及答辯情況表58

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