發(fā)布時(shí)間：2017-06-26 21:11

  本文關(guān)鍵詞：ShRNA沉默ARD1基因?qū)Υ竽c腺癌裸鼠移植瘤生長(zhǎng)及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：[目的]N端乙酰轉(zhuǎn)移酶(N-acetyltransferase)在真核生物中具有極為重要的生物學(xué)功能,人ARD1 (human arrest defective 1,hARD1)基因編碼的N端α位乙�；D(zhuǎn)移酶10蛋白(N-α- acetyltransferase 10 protein,Naa10p)是NatA的催化亞基。hARD1廣泛參與機(jī)體的生物學(xué)過(guò)程,可以將乙酰coA的乙�；�(-CO-CH3)轉(zhuǎn)移到新生多肽N端。hARD1在調(diào)控細(xì)胞凋亡中起著重要作用,與大腸癌的發(fā)生、發(fā)展有著密切的關(guān)系。本研究探討ShRNA沉默ARD1基因?qū)Υ竽c腺癌裸鼠移植瘤的生長(zhǎng)及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響。進(jìn)而為診斷和治療大腸癌提供全新的治療理念和治療措施。[方法]1、大腸腺癌SW620細(xì)胞株的復(fù)蘇與培養(yǎng)。2、干擾質(zhì)粒(pENTRTM/U6-hARDl-shRNA) hARD1的構(gòu)建。3、將成功構(gòu)建的質(zhì)粒pENTRTM/U6-hARD 1-shRNA及空載質(zhì)粒pENTRTM/U6-NC經(jīng)脂質(zhì)體分別轉(zhuǎn)染SW620細(xì)胞。通過(guò)G418 (Geneticin,遺傳霉素)篩選培養(yǎng)基中具有穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞系。然后依次將篩選出的干擾質(zhì)粒整合的細(xì)胞克隆、空載質(zhì)粒整合的細(xì)胞克隆及未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)組、陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組,觀察細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化。4、將裸鼠隨機(jī)分為3組,每組8只,選取裸鼠前肢腋窩中部外側(cè)皮下為注射點(diǎn),三組分別為：皮下注射穩(wěn)定表達(dá)的pENTRTM/U6-hARD1-shRNA細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)組,皮下注射穩(wěn)定表達(dá)的pENTRTM/U6-NC的SW620細(xì)胞為陰性對(duì)照組,皮下注射未轉(zhuǎn)染的SW620細(xì)胞為空白對(duì)照組,精心飼養(yǎng)并隨時(shí)觀察三組移植瘤生長(zhǎng)狀況。5、Realtime-qPCR法檢測(cè)三組大腸腺癌裸鼠移植瘤中P53和Bcl-2中mRNA的表達(dá)情況。6、使用蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)檢測(cè)三組大腸腺癌裸鼠移植瘤組織中ARD1的表達(dá)情況,不同蛋白表達(dá)水平用目的條帶灰度與內(nèi)參GAPDH條帶的灰度比值定量表示。7、使用免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)三組大腸腺癌裸鼠移植瘤細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白P53、 Bcl-2的表達(dá)水平。免疫組織化學(xué)染色用SP法。以半定量法判定結(jié)果,對(duì)每例標(biāo)本隨機(jī)選取3個(gè)不同高倍視野(各計(jì)100個(gè)細(xì)胞),計(jì)算腫瘤細(xì)胞中p53、bcl-2表達(dá)的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。p53、bcl-2蛋白陽(yáng)性細(xì)胞的計(jì)算。陽(yáng)性結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)：Bcl-2陽(yáng)性為細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色顆粒,p53以細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性表達(dá),參考免疫組化評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：無(wú)表達(dá),0分;50%細(xì)胞陽(yáng)性表達(dá)或染色較淺,1分；≥50%陽(yáng)性,2分。0-1分記為陰性(一),2分記為陽(yáng)性(+)。8、經(jīng)四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)檢測(cè)三組大腸腺癌裸鼠移植瘤組織細(xì)胞增殖的情況。9、應(yīng)用spssl9.0軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,數(shù)據(jù)非正態(tài)分布或方差不齊,以中位數(shù)(四分位數(shù)間距)表示,數(shù)據(jù)正態(tài)分布及方差齊性以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,兩組間獨(dú)立樣本采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),P0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。[結(jié)果]1.SW620細(xì)胞株在體外培養(yǎng)成功并且生長(zhǎng)良好。2.成功構(gòu)建hARD1干擾質(zhì)粒,經(jīng)G418篩選出各組轉(zhuǎn)染穩(wěn)定的細(xì)胞系。3.(1)隨著時(shí)間的推移,三組裸鼠瘤體體積逐漸增大。本實(shí)驗(yàn)三組共計(jì)24只裸鼠除空白組有一只死亡外均成瘤,成瘤率達(dá)95.83%。連續(xù)觀察三周后采用頸椎脫臼法將裸鼠處死,仔細(xì)分離皮下移植瘤,測(cè)量并記錄移植瘤質(zhì)量和體積(每次注射前用游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤最長(zhǎng)徑和最短徑,并稱瘤體質(zhì)量。腫瘤體積(V)=最長(zhǎng)徑×最短徑×最短徑/2)。結(jié)果：發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組瘤體質(zhì)量及體積明顯小于陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組,實(shí)驗(yàn)組與陰性對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組與空白對(duì)照組裸鼠移植瘤成瘤體質(zhì)量及體積均差異明顯,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)；陰性對(duì)照組與空白對(duì)照組裸鼠移植瘤成瘤體質(zhì)量及體積差異尚不明顯,無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。(2)前2周無(wú)一裸鼠死亡,第18天空白對(duì)照組有1例死亡。原因與腫瘤巨大、發(fā)生嚴(yán)重的惡液質(zhì)有關(guān)。4. Realtime-qPCR采用2-△△ct法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量,對(duì)三組大腸腺癌裸鼠移植瘤組織P53、Bcl-2 mRNA的表達(dá)分析,實(shí)驗(yàn)組的P53的表達(dá)水平明顯高于陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組；Bcl-2及轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的表達(dá)明顯低于陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組。5. Western blot法檢測(cè)三組大腸癌組織中hARD1蛋白的表達(dá)情況對(duì)三組大腸腺癌裸鼠移植瘤細(xì)胞中hARD1蛋白相對(duì)表達(dá)進(jìn)行灰度值分析表明：三組均有hARD1的表達(dá),實(shí)驗(yàn)組較陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組電泳條帶明顯減弱。6.p53、bcl-2蛋白的表達(dá)三組移植瘤瘤體組織中p53、bcl-2的陽(yáng)性表達(dá)率實(shí)驗(yàn)組分別為87.5%(7/8)、37.5%(3/8)；陰性對(duì)照組分別為37.5%(3/8)、50.0%(4/8)；空白對(duì)照組分別為28.57%(2/7)、85.71%(6/7)。p53的陽(yáng)性表達(dá)率實(shí)驗(yàn)組與陰性對(duì)照、實(shí)驗(yàn)組與空白對(duì)照組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)；陰性對(duì)照組與空白對(duì)照組p53的陽(yáng)性表達(dá)率差異不明顯(P0.05), bcl-2的陽(yáng)性表達(dá)率在實(shí)驗(yàn)組和陰性對(duì)照組、陰性對(duì)照組與空白對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);實(shí)驗(yàn)組與空白對(duì)照組本實(shí)驗(yàn)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。7.MTT檢測(cè)三組大腸腺癌裸鼠移植瘤組織細(xì)胞增殖的情況本方法原理是活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚(Formazan)并沉積在細(xì)胞中,而死細(xì)胞無(wú)此功能�？砷g接反映活細(xì)胞數(shù)量。瘤體從裸鼠身上取出后的48h檢測(cè)三組細(xì)胞的吸光值(A450),計(jì)算出抑制率。其結(jié)果是：實(shí)驗(yàn)組的抑制率明顯高于陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組(P0.05),[結(jié)論]1.本實(shí)驗(yàn)證實(shí)shRNA干擾技術(shù)沉默ARD1基因后的大腸腺癌裸鼠移植瘤組織中,在轉(zhuǎn)錄水平上p53的表達(dá)水平上調(diào)、Bc1-2的表達(dá)往往受到抑制；在蛋白水平上促進(jìn)P53的表達(dá),而對(duì)bcl-2表達(dá)影響作用不明顯。2. shRNA沉默ARD1基因可以抑制大腸腺癌裸鼠皮下移植瘤的生長(zhǎng),為明確shRNA沉默ARD1基因在大腸癌中的作用機(jī)制提供了理論依據(jù)。3.通過(guò)本研究證實(shí)shRNA沉默ARD1后可不同程度調(diào)控凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá),從而抑制大腸腺癌裸鼠移植瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、促進(jìn)其凋亡。
【關(guān)鍵詞】：人停滯缺陷蛋白1 RNA干擾 大腸癌 裸鼠 移植瘤 p53 bcl-2
【學(xué)位授予單位】：昆明醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R735.34
【目錄】：

• 縮略詞表5-7
• 中文摘要7-10
• 英文摘要10-15
• 前言15-21
• 實(shí)驗(yàn)材料及方法21-36
• 結(jié)果36-46
• 討論46-50
• 結(jié)論50-51
• 參考文獻(xiàn)51-55
• 附錄55-57
• 綜述57-66
• 參考文獻(xiàn)63-66
• 攻讀學(xué)位期間獲得的學(xué)術(shù)成果66-67
• 致謝67

【相似文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 張靜,喬慶,馬慶久,賴大年;人類大腸腺癌組織中凋亡相關(guān)基因的研究(英文)[J];中國(guó)臨床康復(fù);2004年17期

2 王紅玲,鄧長(zhǎng)生,林軍,潘定宇,鄒祖玉;促血管生成素家族在大腸腺癌中的表達(dá)及與微血管密度和臨床病理特征的關(guān)系[J];中華實(shí)驗(yàn)外科雜志;2005年10期

3 馮俊偉;鄭寶軍;潘立峰;邵建富;;核轉(zhuǎn)錄因子-κB、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子在大腸腺癌組織中表達(dá)的研究[J];山東醫(yī)藥;2006年27期

4 索智敏;任學(xué)群;康玉華;;缺氧誘導(dǎo)因子-1α在大腸腺癌組織中的表達(dá)及與血管生成的關(guān)系[J];中國(guó)醫(yī)師進(jìn)修雜志;2006年28期

5 程勝平;劉南植;;缺氧誘導(dǎo)因子-1α在大腸腺癌組織中的表達(dá)意義[J];浙江中西醫(yī)結(jié)合雜志;2006年12期

6 陳謙;柯娟;王紀(jì)全;鄧懷慈;;大腸腺癌中基質(zhì)金屬蛋白酶-2、9及其抑制劑-1、2的表達(dá)[J];西安交通大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版);2009年04期

7 張俊英;徐曉磊;李培秀;;大腸腺癌內(nèi)鏡與病理檢查對(duì)照分析[J];胃腸病學(xué)和肝病學(xué)雜志;2011年03期

8 韓黎麗;劉宇;鄧文英;陳小兵;李寧;羅素霞;;神經(jīng)型鈣黏附蛋白在大腸腺癌組織中的表達(dá)及意義[J];山東醫(yī)藥;2011年35期

9 段瑞;;炎性腸病相關(guān)的大腸腺癌臨床特征的研究:與散發(fā)微衛(wèi)星穩(wěn)定性和林奇綜合征相關(guān)性大腸腺癌的比較(英)[J];診斷病理學(xué)雜志;2013年03期

10 彭大穎;姜麗紅;徐秀月;姜秀春;王曉莉;肖月;高志安;;大腸腺癌組織中乙酰肝素酶及堿性成纖維細(xì)胞因子的表達(dá)[J];中國(guó)老年學(xué)雜志;2013年17期

中國(guó)重要會(huì)議論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前6條

1 王紅玲;鄧長(zhǎng)生;;促血管生成素家族在大腸腺癌中的表達(dá)及與微血管密度和臨床病理特征的關(guān)系[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)第七次全國(guó)消化病學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編（下冊(cè)）[C];2007年

2 戴益琛;陳章興;謝軍培;曾偉;傅育卡;林志翔;姜元芹;朱小三;;大腸腺瘤與大腸腺癌腫瘤相關(guān)基因?qū)Ρ妊芯縖A];第二十二屆全國(guó)中西醫(yī)結(jié)合消化系統(tǒng)疾病學(xué)術(shù)會(huì)議暨消化疾病診治進(jìn)展學(xué)習(xí)班論文匯編[C];2010年

3 鄭淑芳;侯峰;展曉紅;何滔;王劍威;;NF-κB和CXCR4在大腸腺癌中的表達(dá)及臨床意義[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)病理學(xué)分會(huì)2010年學(xué)術(shù)年會(huì)日程及論文匯編[C];2010年

4 王開昕;李明華;舒江喬;凌銘;王芳;;P57_(KIP2)在人大腸腺癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的作用研究[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)病理學(xué)分會(huì)2005年學(xué)術(shù)年會(huì)論文匯編[C];2005年

5 岳輝;冼文勇;張寧;楊琳;蔣會(huì)勇;;大腸腺癌組織p57~(kip2)蛋白和基因表達(dá)及與臨床病理關(guān)系研究[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)第七次全國(guó)消化病學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編（下冊(cè)）[C];2007年

6 季晨陽(yáng);季丹;;p53 cDNA突變和突變型蛋白與大腸癌預(yù)后的關(guān)系[A];2000全國(guó)腫瘤學(xué)術(shù)大會(huì)論文集[C];2000年

中國(guó)博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前2條

1 張友才;微衛(wèi)星不穩(wěn)定性大腸腺癌腫瘤抑制基因CpG島甲基化研究[D];武漢大學(xué);2004年

2 陳壬寅;EphA2在大腸腺癌中的表達(dá)及其表達(dá)的體外抑制研究[D];鄭州大學(xué);2005年

中國(guó)碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 張輝;COX-2和CEA在大腸腫瘤中表達(dá)的研究[D];大連醫(yī)科大學(xué);2015年

2 陳超;ShRNA沉默ARD1基因?qū)Υ竽c腺癌裸鼠移植瘤生長(zhǎng)及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響[D];昆明醫(yī)科大學(xué);2016年

3 譚風(fēng)波;血管生成素-2與大腸腺癌血管及淋巴管生成的相關(guān)性研究[D];南華大學(xué);2010年

4 李玲玲;大腸腺癌病理與中醫(yī)證型、體質(zhì)的相關(guān)性研究[D];福建中醫(yī)藥大學(xué);2013年

5 金卉;大腸腺癌中鞘氨醇激酶-1與1-磷酸鞘氨醇受體mRNA和蛋白表達(dá)的研究[D];廣西醫(yī)科大學(xué);2010年

6 李碩;hARD1過(guò)表達(dá)對(duì)大腸腺癌細(xì)胞株凋亡的影響研究[D];昆明醫(yī)科大學(xué);2013年

7 張慧青;EPHA2在大腸腺癌中的表達(dá)及意義[D];中南大學(xué);2008年

8 展曉紅;SDF-1及其受體CXCR4在大腸腺癌中的表達(dá)及臨床意義[D];青島大學(xué);2009年

9 陳億;~（125）I粒子對(duì)低分化大腸腺癌HIF-1α的表達(dá)影響及細(xì)胞增殖和凋亡的實(shí)驗(yàn)研究[D];昆明醫(yī)學(xué)院;2010年

10 趙佳;Survivin與β-catenin在大腸腺癌中的表達(dá)及意義[D];遼寧醫(yī)學(xué)院;2014年

  本文關(guān)鍵詞：ShRNA沉默ARD1基因?qū)Υ竽c腺癌裸鼠移植瘤生長(zhǎng)及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：487601