本文關鍵詞：ShRNA沉默ARD1基因對大腸腺癌裸鼠移植瘤生長及凋亡相關蛋白表達的影響，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：[目的]N端乙酰轉移酶(N-acetyltransferase)在真核生物中具有極為重要的生物學功能,人ARD1 (human arrest defective 1,hARD1)基因編碼的N端α位乙�；D移酶10蛋白(N-α- acetyltransferase 10 protein,Naa10p)是NatA的催化亞基。hARD1廣泛參與機體的生物學過程,可以將乙酰coA的乙�；�(-CO-CH3)轉移到新生多肽N端。hARD1在調控細胞凋亡中起著重要作用,與大腸癌的發(fā)生、發(fā)展有著密切的關系。本研究探討ShRNA沉默ARD1基因對大腸腺癌裸鼠移植瘤的生長及凋亡相關蛋白表達的影響。進而為診斷和治療大腸癌提供全新的治療理念和治療措施。[方法]1、大腸腺癌SW620細胞株的復蘇與培養(yǎng)。2、干擾質粒(pENTRTM/U6-hARDl-shRNA) hARD1的構建。3、將成功構建的質粒pENTRTM/U6-hARD 1-shRNA及空載質粒pENTRTM/U6-NC經脂質體分別轉染SW620細胞。通過G418 (Geneticin,遺傳霉素)篩選培養(yǎng)基中具有穩(wěn)定表達的細胞系。然后依次將篩選出的干擾質粒整合的細胞克隆、空載質粒整合的細胞克隆及未轉染的細胞作為實驗組、陰性對照組和空白對照組,觀察細胞的形態(tài)學變化。4、將裸鼠隨機分為3組,每組8只,選取裸鼠前肢腋窩中部外側皮下為注射點,三組分別為：皮下注射穩(wěn)定表達的pENTRTM/U6-hARD1-shRNA細胞為實驗組,皮下注射穩(wěn)定表達的pENTRTM/U6-NC的SW620細胞為陰性對照組,皮下注射未轉染的SW620細胞為空白對照組,精心飼養(yǎng)并隨時觀察三組移植瘤生長狀況。5、Realtime-qPCR法檢測三組大腸腺癌裸鼠移植瘤中P53和Bcl-2中mRNA的表達情況。6、使用蛋白質印跡法(Western blot)檢測三組大腸腺癌裸鼠移植瘤組織中ARD1的表達情況,不同蛋白表達水平用目的條帶灰度與內參GAPDH條帶的灰度比值定量表示。7、使用免疫細胞化學法檢測三組大腸腺癌裸鼠移植瘤細胞中凋亡相關蛋白P53、 Bcl-2的表達水平。免疫組織化學染色用SP法。以半定量法判定結果,對每例標本隨機選取3個不同高倍視野(各計100個細胞),計算腫瘤細胞中p53、bcl-2表達的陽性細胞數(shù)。p53、bcl-2蛋白陽性細胞的計算。陽性結果判斷標準：Bcl-2陽性為細胞質出現(xiàn)棕黃色顆粒,p53以細胞核內出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性表達,參考免疫組化評分標準：無表達,0分;50%細胞陽性表達或染色較淺,1分；≥50%陽性,2分。0-1分記為陰性(一),2分記為陽性(+)。8、經四甲基偶氮唑藍(MTT)檢測三組大腸腺癌裸鼠移植瘤組織細胞增殖的情況。9、應用spssl9.0軟件對所得數(shù)據進行統(tǒng)計分析,數(shù)據非正態(tài)分布或方差不齊,以中位數(shù)(四分位數(shù)間距)表示,數(shù)據正態(tài)分布及方差齊性以均數(shù)±標準差表示,兩組間獨立樣本采用兩獨立樣本t檢驗,P0.05為差異有統(tǒng)計學意義。[結果]1.SW620細胞株在體外培養(yǎng)成功并且生長良好。2.成功構建hARD1干擾質粒,經G418篩選出各組轉染穩(wěn)定的細胞系。3.(1)隨著時間的推移,三組裸鼠瘤體體積逐漸增大。本實驗三組共計24只裸鼠除空白組有一只死亡外均成瘤,成瘤率達95.83%。連續(xù)觀察三周后采用頸椎脫臼法將裸鼠處死,仔細分離皮下移植瘤,測量并記錄移植瘤質量和體積(每次注射前用游標卡尺測量腫瘤最長徑和最短徑,并稱瘤體質量。腫瘤體積(V)=最長徑×最短徑×最短徑/2)。結果：發(fā)現(xiàn)實驗組瘤體質量及體積明顯小于陰性對照組和空白對照組,實驗組與陰性對照組、實驗組與空白對照組裸鼠移植瘤成瘤體質量及體積均差異明顯,具有統(tǒng)計學意義(P0.05)；陰性對照組與空白對照組裸鼠移植瘤成瘤體質量及體積差異尚不明顯,無統(tǒng)計學意義(P0.05)。(2)前2周無一裸鼠死亡,第18天空白對照組有1例死亡。原因與腫瘤巨大、發(fā)生嚴重的惡液質有關。4. Realtime-qPCR采用2-△△ct法計算相對表達量,對三組大腸腺癌裸鼠移植瘤組織P53、Bcl-2 mRNA的表達分析,實驗組的P53的表達水平明顯高于陰性對照組和空白對照組；Bcl-2及轉錄產物的表達明顯低于陰性對照組和空白對照組。5. Western blot法檢測三組大腸癌組織中hARD1蛋白的表達情況對三組大腸腺癌裸鼠移植瘤細胞中hARD1蛋白相對表達進行灰度值分析表明：三組均有hARD1的表達,實驗組較陰性對照組和空白對照組電泳條帶明顯減弱。6.p53、bcl-2蛋白的表達三組移植瘤瘤體組織中p53、bcl-2的陽性表達率實驗組分別為87.5%(7/8)、37.5%(3/8)；陰性對照組分別為37.5%(3/8)、50.0%(4/8)；空白對照組分別為28.57%(2/7)、85.71%(6/7)。p53的陽性表達率實驗組與陰性對照、實驗組與空白對照組差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)；陰性對照組與空白對照組p53的陽性表達率差異不明顯(P0.05), bcl-2的陽性表達率在實驗組和陰性對照組、陰性對照組與空白對照組差異無統(tǒng)計學意義(P0.05);實驗組與空白對照組本實驗差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。7.MTT檢測三組大腸腺癌裸鼠移植瘤組織細胞增殖的情況本方法原理是活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍紫色結晶甲瓚(Formazan)并沉積在細胞中,而死細胞無此功能�？砷g接反映活細胞數(shù)量。瘤體從裸鼠身上取出后的48h檢測三組細胞的吸光值(A450),計算出抑制率。其結果是：實驗組的抑制率明顯高于陰性對照組和空白對照組(P0.05),[結論]1.本實驗證實shRNA干擾技術沉默ARD1基因后的大腸腺癌裸鼠移植瘤組織中,在轉錄水平上p53的表達水平上調、Bc1-2的表達往往受到抑制；在蛋白水平上促進P53的表達,而對bcl-2表達影響作用不明顯。2. shRNA沉默ARD1基因可以抑制大腸腺癌裸鼠皮下移植瘤的生長,為明確shRNA沉默ARD1基因在大腸癌中的作用機制提供了理論依據。3.通過本研究證實shRNA沉默ARD1后可不同程度調控凋亡相關蛋白的表達,從而抑制大腸腺癌裸鼠移植瘤細胞的生長、促進其凋亡。
【關鍵詞】：人停滯缺陷蛋白1 RNA干擾 大腸癌 裸鼠 移植瘤 p53 bcl-2
【學位授予單位】：昆明醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R735.34
【目錄】：

• 縮略詞表5-7
• 中文摘要7-10
• 英文摘要10-15
• 前言15-21
• 實驗材料及方法21-36
• 結果36-46
• 討論46-50
• 結論50-51
• 參考文獻51-55
• 附錄55-57
• 綜述57-66
• 參考文獻63-66
• 攻讀學位期間獲得的學術成果66-67
• 致謝67

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  本文關鍵詞：ShRNA沉默ARD1基因對大腸腺癌裸鼠移植瘤生長及凋亡相關蛋白表達的影響，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：487601