本文關(guān)鍵詞：HnRNP L在膀胱癌發(fā)生發(fā)展中的功能和分子機(jī)制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：背景與目的：膀胱癌指發(fā)生于膀胱黏膜上的惡性腫瘤,其為泌尿系統(tǒng)最常見(jiàn)的惡性腫瘤,在歐美其發(fā)病率居男性惡性腫瘤的第四位,為世界6大常見(jiàn)腫瘤之一,在我國(guó)其發(fā)病率近年來(lái)也呈明顯上升趨勢(shì)。膀胱癌分為非肌層浸潤(rùn)性膀胱癌和肌層浸潤(rùn)性膀胱癌兩大類。其中70%-90%新確診的膀胱癌病例均為為非肌層浸潤(rùn)性膀胱癌,在行腔內(nèi)膀胱腫瘤切除術(shù)后,即使嚴(yán)格的膀胱內(nèi)灌注化療,依然有約10%-40%的復(fù)發(fā)率,而在復(fù)發(fā)病例中有近5%-30%可能進(jìn)展為肌層浸潤(rùn)性膀胱癌甚至發(fā)生轉(zhuǎn)移,此類浸潤(rùn)性膀胱癌患者在行全膀胱切除術(shù)后5年生存率僅有為60%-70%。此外,膀胱癌目前主要依賴于膀胱鏡檢查來(lái)監(jiān)測(cè)和診斷,然而由于膀胱鏡為侵入性操作,且檢查費(fèi)用昂貴且費(fèi)時(shí),給患者帶來(lái)沉重的負(fù)擔(dān),不能得到患者很好的接受和配合。尿液脫落細(xì)胞學(xué)檢查在發(fā)現(xiàn)晚期膀胱癌方面有很高的敏感性,然而在早期敏感性很低,且其診斷與臨床病理醫(yī)師的經(jīng)驗(yàn)密不可分�？偟膩�(lái)說(shuō),目前尚缺乏可用于膀胱癌早期診斷、治療及預(yù)測(cè)進(jìn)展的高敏感性和特異性的檢查手段及分子標(biāo)志物,解決這些問(wèn)題仍依賴于基礎(chǔ)研究的重大進(jìn)展。膀胱癌發(fā)生是一個(gè)多基因、多因素參與的復(fù)雜過(guò)程。已知癌基因的激活和抑癌基因的失活與膀胱癌發(fā)生關(guān)系密切。其中HER-2、H-Ras、Bcl-2、C-myc等基因突變可導(dǎo)致調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、DNA修復(fù)或凋亡的蛋白抑制基因失活,這些基因的改變使DNA受損的細(xì)胞不發(fā)生凋亡,導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)失控,從而促進(jìn)膀胱腫瘤的發(fā)生發(fā)展；而抑癌基因P53、RK、P21等失活導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞增殖不受限制,進(jìn)一步加速膀胱癌的進(jìn)展。此外,膀胱癌發(fā)生也與編碼生長(zhǎng)因子或其受體的正�；驍U(kuò)增或過(guò)表達(dá)有關(guān),如EGEF表達(dá)水平的提高可增加膀胱癌的侵襲及轉(zhuǎn)移能力。這一系列分子生物學(xué)改變?cè)诎螂装┌l(fā)生發(fā)展過(guò)程中扮演重要角色。然而,現(xiàn)階段膀胱癌發(fā)生發(fā)展的許多機(jī)制尚不清楚,仍有待于深入的研究闡明�；诖�,深入研究膀胱癌的發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移分子機(jī)制,尋找一種敏感性高、特異性強(qiáng)能夠預(yù)測(cè)膀胱癌細(xì)胞的生物學(xué)行為,作為評(píng)估膀胱癌發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移能力和判斷患者預(yù)后的指標(biāo),從而提高膀胱癌患者的生存率、改善生活質(zhì)量顯得尤為重要。核內(nèi)不均一核糖核蛋白L(Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein L,hnRNPL)的基因定位于19q13.2,編碼hnRNPL蛋白。HnRNP L是機(jī)體表達(dá)量豐富且功能多樣的可穿梭于胞漿和胞核之間的蛋白質(zhì),為核內(nèi)不均一核糖核蛋白(核蛋白hnRNP)復(fù)合體的重要組成部分。HnRNP是一類RNA結(jié)合蛋白,其主要集中于細(xì)胞核區(qū),通過(guò)特異的結(jié)構(gòu)與Pre-mRNA結(jié)合,形成Pre-mRNPs復(fù)合體,參與mRNA轉(zhuǎn)運(yùn)、代謝、剪切及表達(dá)等過(guò)程的調(diào)節(jié)。已有的文獻(xiàn)報(bào)道顯示hnRNP家族成員參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移等生物學(xué)進(jìn)程,其可調(diào)節(jié)基因表達(dá)、抑制細(xì)胞凋亡、促進(jìn)血管生成及增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力。作為hnRNPs家族成員之一的hnRNPL主要通過(guò)優(yōu)先結(jié)合CA重復(fù)序列或某些CA豐富序列進(jìn)而發(fā)揮調(diào)控作用,主要包括在可變剪接過(guò)程中調(diào)節(jié)選擇外顯子、促進(jìn)聚腺苷酸化、協(xié)助輸出無(wú)內(nèi)含子的基因mRNA,促進(jìn)內(nèi)部核糖體進(jìn)位點(diǎn)翻譯、調(diào)節(jié)mRNA穩(wěn)定性等。已有的文獻(xiàn)報(bào)道顯示hnRNP L的表達(dá)失調(diào)與腫瘤的關(guān)系密切,其在腫瘤中主要發(fā)揮促進(jìn)細(xì)胞增殖、遷移、侵襲、粘附等能力。近年來(lái)有關(guān)hnRNP L在腫瘤中的研究報(bào)已證實(shí)hnRNP L可參與食管鱗狀細(xì)胞癌、肝癌、肺癌、轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌和乳腺癌等多種腫瘤發(fā)生,如hnRNP L與含有外顯子3的caspase-9a前體mRNA優(yōu)先結(jié)合,導(dǎo)致其降解,進(jìn)而影響caspase-9 mRNA亞型的表達(dá),最終調(diào)控非小細(xì)胞肺癌發(fā)生；在肝癌細(xì)胞中干擾hnRNPL的表達(dá)后,腫瘤細(xì)胞增殖、遷移能力顯著減低。HnRNPL參與眾多腫瘤生物學(xué)行為的調(diào)節(jié),然而迄今為止尚未有hnRNPL參與膀胱癌的生物學(xué)進(jìn)程的文獻(xiàn)報(bào)道。我們前期工作中通過(guò)膀胱癌組織芯片的免疫組化檢測(cè)發(fā)現(xiàn)hnRNPL在膀胱癌組織中表達(dá)上調(diào),其高表達(dá)與膀胱癌進(jìn)程有密切聯(lián)系。然而,目前hnRNPL在膀胱癌中的發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移中的是否也發(fā)揮同樣的功能至今仍不清楚,hnRNPL在膀胱癌中高表達(dá),其可能的調(diào)控機(jī)制亦知之甚少。本課題擬檢測(cè)hnRNPL在膀胱癌中的表達(dá)情況,分析其表達(dá)與患者相關(guān)臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系；通過(guò)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)對(duì)hnRNPL在膀胱癌增殖、凋亡及侵襲轉(zhuǎn)移中的功能進(jìn)行研究；同時(shí)探究hnRNPL在膀胱癌中異常高表達(dá)可能的下游作用機(jī)制。本研究的開(kāi)展有助于為膀胱癌生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移機(jī)制提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)及思路；最終可為膀胱癌臨床早期診斷、治療及預(yù)后判斷提供可靠的新型分子標(biāo)志物。研究方法：(1) HnRNPL在膀胱癌組織及細(xì)胞中的表達(dá)采用蛋白免疫印跡(Western blot)和熒光光定量PCR檢測(cè)hnRNPL在膀胱癌組織和癌旁非腫瘤組織中的表達(dá),檢測(cè)hnRNPL在正常膀胱移行上皮細(xì)胞SV-HUC-1及膀胱癌細(xì)胞UM-UC-3、EJ、T24、5637中的表達(dá)；(2) HnRNPL在膀胱癌組織表達(dá)及其與患者臨床參數(shù)之間相關(guān)性應(yīng)用免疫組化(IHC)檢測(cè)膀胱癌石蠟樣本中hnRNPL的表達(dá),并分析hnRNPL的表達(dá)與腫瘤的分化、分期和臨床預(yù)后等相關(guān)病理參數(shù)之間的關(guān)系；(3) HnRNPL在膀胱癌中的生物學(xué)功能建立hnRNPL穩(wěn)定干擾和過(guò)表達(dá)的膀胱癌細(xì)胞株,通過(guò)CCK-8、平板克隆形成實(shí)驗(yàn)和裸鼠皮下成瘤檢測(cè)細(xì)胞增殖改變情況,利用Transwell實(shí)驗(yàn)及劃痕愈合實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲遷移能力變化,通過(guò)流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期分布及細(xì)胞凋亡的改變；(4) HnRNPL在膀胱癌進(jìn)展過(guò)程中的作用機(jī)制運(yùn)用、Western blot凋亡相關(guān)蛋白caspase-3、caspase-6、caspase-9、Bcl-2、 Bcl2L1、PARP1的改變以及MAPK信號(hào)通路(p-ERK1/2、p-P38、p-JNK)及Nrf2、E2F1的激活情況。利用熒光定量PCR和Western blot檢測(cè)hnRNPL穩(wěn)定敲低和過(guò)表達(dá)后EMT標(biāo)志物(E-cadherin、Vimentin、Claudin-1、ZO-1、β-catenin、 ZEB1、snail)的變化。結(jié)果：(1)膀胱癌組織中hnRNPL蛋白的表達(dá)水平檢測(cè)IHC結(jié)果顯示hnRNPL蛋白陽(yáng)性表達(dá)主要定位于細(xì)胞核,呈棕黃色或棕褐色,在74.2%(115/155)的膀胱癌患者中呈陽(yáng)性表達(dá),正常膀胱組織hnRNPL蛋白表達(dá)陽(yáng)性率低于其配對(duì)腫瘤組織；Western blot和qRT-PCR結(jié)果顯示膀胱癌組織中的hnRNPL蛋白及nRNA表達(dá)水平高于其配對(duì)的正常膀胱組織；(2) HnRNPL蛋白表達(dá)和臨床病理參數(shù)的關(guān)系在膀胱癌組織中,hnRNPL蛋白表達(dá)與年齡、TNM分期、臨床病理分級(jí)及組織學(xué)分級(jí)明顯相關(guān)(P0.05),而與患者的性別無(wú)明顯相關(guān)(P0.05)；Kaplan-Meier法分析顯示hnRNPL高表達(dá)組膀胱癌患者的5年生存率要顯著低于低表達(dá)組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Log rank, P0.05);多因素Cox風(fēng)險(xiǎn)比例模型分析顯示：hnRNPL是影響膀胱癌患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P=0.001)；(3) HnRNPL表達(dá)對(duì)膀胱癌細(xì)胞生物學(xué)功能的影響3.1 HnRNPL穩(wěn)定干擾和過(guò)表達(dá)的膀胱癌細(xì)胞株構(gòu)建Western blot驗(yàn)證結(jié)果表明慢病毒表達(dá)載體轉(zhuǎn)染后,成功構(gòu)建了hnRNPL穩(wěn)定干擾和過(guò)表達(dá)的膀胱癌細(xì)胞株；3.2 HnRNPL穩(wěn)定干擾和過(guò)表達(dá)對(duì)膀胱癌細(xì)胞增殖能力的影響CCK-8結(jié)果顯示：與對(duì)照組相比,hnRNPL穩(wěn)定干擾組的細(xì)胞生長(zhǎng)速度顯著下降(P0.05),而過(guò)表達(dá)組細(xì)胞生長(zhǎng)速度顯著快于對(duì)照組(P0.05)；平板克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：與對(duì)照組相比,hnRNPL穩(wěn)定干擾組形成的克隆數(shù)量顯著減少(P0.05),而過(guò)表達(dá)組形成的克隆數(shù)量顯著增加(P0.05)；裸鼠皮下成瘤結(jié)果顯示：與對(duì)照組相比,hnRNPL穩(wěn)定干擾組腫瘤生長(zhǎng)速度明顯減慢,腫瘤重量較輕(P0.05)；3.3 HnRNPL穩(wěn)定干擾和過(guò)表達(dá)對(duì)膀胱癌細(xì)胞EMT表型及遷移能力影響Western blot結(jié)果顯示在膀胱癌細(xì)胞株UM-UC-3和EJ中干擾hnRNPL的表達(dá)后上皮標(biāo)志物E-cadherin的表達(dá)上調(diào),而間質(zhì)標(biāo)志物Vimentin的表達(dá)下調(diào)；相反,在UM-UC-3和EJ細(xì)胞株中穩(wěn)定過(guò)表達(dá)hnRNPL后,上皮標(biāo)志物E-cadherin的表達(dá)下調(diào),而間質(zhì)標(biāo)志物Vimentin的表達(dá)上調(diào)；Transwell遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：hnRNPL穩(wěn)定干擾組的細(xì)胞較對(duì)照組遷移數(shù)量明顯減少(P0.05),而hnRNPL過(guò)表達(dá)細(xì)胞株遷移數(shù)量明顯多于對(duì)照組(P0.05)。劃痕愈合實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：與對(duì)照組相比,hnRNPL穩(wěn)定干擾組的細(xì)胞株遷移速度明顯減慢(P0.05),而hnRNPL過(guò)表達(dá)細(xì)胞株遷移速度顯著增快(P0.05)；3.4 HnRNPL穩(wěn)定干擾和過(guò)表達(dá)對(duì)膀胱癌細(xì)胞周期分布和細(xì)胞凋亡的影響流式細(xì)胞術(shù)細(xì)胞周期檢測(cè)結(jié)果顯示：與對(duì)照組相比,hnRNPL穩(wěn)定干擾組的細(xì)胞G1期比例明顯增加,S期比例明顯減少,細(xì)胞發(fā)生G1期阻滯(P0.05),細(xì)胞周期進(jìn)程明顯減慢；而hnRNPL過(guò)表達(dá)后,與對(duì)照組相比,G1期細(xì)胞比例明顯減少,S期細(xì)胞比例明顯增加(P0.05),細(xì)胞周期進(jìn)程明顯加快。細(xì)胞凋亡檢測(cè)結(jié)果顯示：與對(duì)照組相比,hnRNPL穩(wěn)定干擾組的細(xì)胞凋亡比例明顯增加(P0.05),而hnRNPL過(guò)表達(dá)細(xì)胞株細(xì)胞凋亡比例顯著增加(P0.05)；3.5 HnRNPL在膀胱癌中的作用機(jī)制Western blot結(jié)果顯示膀胱癌細(xì)胞株UM-UC-3和EJ中干擾hnRNPL表達(dá)后,caspase-3、caspase-6、caspase-9、Bcl-xL表達(dá)上調(diào),而B(niǎo)cl-2、PARP1的表達(dá)下調(diào)；在兩株細(xì)胞中穩(wěn)定過(guò)表達(dá)hnRNPL后,結(jié)果則相反。HnRNPL表達(dá)干擾后p-ERK1/2、p-P38、p-JNK、NRF2、E2F1表達(dá)下調(diào),在兩株細(xì)胞中穩(wěn)定過(guò)表達(dá)hnRNPL后,結(jié)果則相反；JNK在hnRNPL穩(wěn)定干擾和過(guò)表達(dá)同對(duì)照比較變化不明顯。qRT-PCR結(jié)果顯示穩(wěn)定干擾hnRNPL后E-cadherin的nRNA表達(dá)水平上調(diào),而Vimentin的mRNA表達(dá)水平下調(diào),相應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子ZEB1、ZEB2、snail、slug、mRNA表達(dá)水平均下調(diào)；Western blot結(jié)果表明干擾hnRNPL的表達(dá)后,E-cadherin, claudin-1及ZO-1表達(dá)上調(diào),而Vimentin、ZEB1, β-catenin表達(dá)下調(diào)；過(guò)表達(dá)hnRNPL后結(jié)果與之相反,且過(guò)表達(dá)后E-cadherin轉(zhuǎn)錄抑制因子snail表達(dá)水平上調(diào)。結(jié)論：(1)膀胱癌組織中hnRNPL的表達(dá)水平顯著高于癌旁非腫瘤組織,hnRNPL的表達(dá)水平與組織學(xué)分級(jí)、臨床分期、TNM分期以及預(yù)后密切相關(guān)；hnRNPL高表達(dá)患者,預(yù)后較差；(2) HnRNPL干擾可抑制膀胱癌細(xì)胞的增殖、遷移能力,抑制EMT表型轉(zhuǎn)化,誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡,使細(xì)胞周期阻滯在G1期；而過(guò)表達(dá)hnRNPL可促進(jìn)膀胱癌細(xì)胞EMT表型轉(zhuǎn)化、侵襲和遷移能力,抑制腫瘤細(xì)胞凋亡,使細(xì)胞周期進(jìn)程加快；(3) HnRNPL可能通過(guò)調(diào)節(jié)P53/Bcl2/Caspase信號(hào)通路和IMAPK信號(hào)通路活性及E2F1等參與膀胱癌細(xì)胞的增殖、凋亡及遷移。
【關(guān)鍵詞】：膀胱癌 hnRNP L 預(yù)后 增殖 凋亡 遷移
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R737.14
【目錄】：

• 摘要3-9
• ABSTRACT9-19
• 前言19-24
• 技術(shù)路線24-25
• 第一章 HnRNP L在人膀胱癌組織中的表達(dá)及其臨床意義25-44
• 一. 材料與方法25-34
• 二. 結(jié)果34-42
• 三. 結(jié)論42
• 四. 討論42-44
• 第二章 HnRNP L基因干擾和過(guò)表達(dá)對(duì)膀胱癌細(xì)胞生物學(xué)功能的影響44-66
• 一. 材料與方法44-49
• 二. 結(jié)果49-63
• 三. 結(jié)論63
• 四. 討論63-66
• 第三章 膀胱癌中hnRNP L調(diào)控機(jī)制的初步研究66-84
• 一. 材料與方法66-71
• 二. 結(jié)果71-79
• 三. 結(jié)論79
• 四. 討論79-84
• 全文總結(jié)84-85
• 參考文獻(xiàn)85-95
• 在讀期間發(fā)表的論文95
• 在讀期間參與課題研究95-96
• 致謝96-97

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本文編號(hào)：485317