本文關(guān)鍵詞：HnRNP L在膀胱癌發(fā)生發(fā)展中的功能和分子機制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：背景與目的：膀胱癌指發(fā)生于膀胱黏膜上的惡性腫瘤,其為泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤,在歐美其發(fā)病率居男性惡性腫瘤的第四位,為世界6大常見腫瘤之一,在我國其發(fā)病率近年來也呈明顯上升趨勢。膀胱癌分為非肌層浸潤性膀胱癌和肌層浸潤性膀胱癌兩大類。其中70%-90%新確診的膀胱癌病例均為為非肌層浸潤性膀胱癌,在行腔內(nèi)膀胱腫瘤切除術(shù)后,即使嚴格的膀胱內(nèi)灌注化療,依然有約10%-40%的復(fù)發(fā)率,而在復(fù)發(fā)病例中有近5%-30%可能進展為肌層浸潤性膀胱癌甚至發(fā)生轉(zhuǎn)移,此類浸潤性膀胱癌患者在行全膀胱切除術(shù)后5年生存率僅有為60%-70%。此外,膀胱癌目前主要依賴于膀胱鏡檢查來監(jiān)測和診斷,然而由于膀胱鏡為侵入性操作,且檢查費用昂貴且費時,給患者帶來沉重的負擔,不能得到患者很好的接受和配合。尿液脫落細胞學檢查在發(fā)現(xiàn)晚期膀胱癌方面有很高的敏感性,然而在早期敏感性很低,且其診斷與臨床病理醫(yī)師的經(jīng)驗密不可分�？偟膩碚f,目前尚缺乏可用于膀胱癌早期診斷、治療及預(yù)測進展的高敏感性和特異性的檢查手段及分子標志物,解決這些問題仍依賴于基礎(chǔ)研究的重大進展。膀胱癌發(fā)生是一個多基因、多因素參與的復(fù)雜過程。已知癌基因的激活和抑癌基因的失活與膀胱癌發(fā)生關(guān)系密切。其中HER-2、H-Ras、Bcl-2、C-myc等基因突變可導(dǎo)致調(diào)節(jié)細胞生長、DNA修復(fù)或凋亡的蛋白抑制基因失活,這些基因的改變使DNA受損的細胞不發(fā)生凋亡,導(dǎo)致細胞生長失控,從而促進膀胱腫瘤的發(fā)生發(fā)展；而抑癌基因P53、RK、P21等失活導(dǎo)致腫瘤細胞增殖不受限制,進一步加速膀胱癌的進展。此外,膀胱癌發(fā)生也與編碼生長因子或其受體的正�；驍U增或過表達有關(guān),如EGEF表達水平的提高可增加膀胱癌的侵襲及轉(zhuǎn)移能力。這一系列分子生物學改變在膀胱癌發(fā)生發(fā)展過程中扮演重要角色。然而,現(xiàn)階段膀胱癌發(fā)生發(fā)展的許多機制尚不清楚,仍有待于深入的研究闡明。基于此,深入研究膀胱癌的發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移分子機制,尋找一種敏感性高、特異性強能夠預(yù)測膀胱癌細胞的生物學行為,作為評估膀胱癌發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移能力和判斷患者預(yù)后的指標,從而提高膀胱癌患者的生存率、改善生活質(zhì)量顯得尤為重要。核內(nèi)不均一核糖核蛋白L(Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein L,hnRNPL)的基因定位于19q13.2,編碼hnRNPL蛋白。HnRNP L是機體表達量豐富且功能多樣的可穿梭于胞漿和胞核之間的蛋白質(zhì),為核內(nèi)不均一核糖核蛋白(核蛋白hnRNP)復(fù)合體的重要組成部分。HnRNP是一類RNA結(jié)合蛋白,其主要集中于細胞核區(qū),通過特異的結(jié)構(gòu)與Pre-mRNA結(jié)合,形成Pre-mRNPs復(fù)合體,參與mRNA轉(zhuǎn)運、代謝、剪切及表達等過程的調(diào)節(jié)。已有的文獻報道顯示hnRNP家族成員參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移等生物學進程,其可調(diào)節(jié)基因表達、抑制細胞凋亡、促進血管生成及增強腫瘤細胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力。作為hnRNPs家族成員之一的hnRNPL主要通過優(yōu)先結(jié)合CA重復(fù)序列或某些CA豐富序列進而發(fā)揮調(diào)控作用,主要包括在可變剪接過程中調(diào)節(jié)選擇外顯子、促進聚腺苷酸化、協(xié)助輸出無內(nèi)含子的基因mRNA,促進內(nèi)部核糖體進位點翻譯、調(diào)節(jié)mRNA穩(wěn)定性等。已有的文獻報道顯示hnRNP L的表達失調(diào)與腫瘤的關(guān)系密切,其在腫瘤中主要發(fā)揮促進細胞增殖、遷移、侵襲、粘附等能力。近年來有關(guān)hnRNP L在腫瘤中的研究報已證實hnRNP L可參與食管鱗狀細胞癌、肝癌、肺癌、轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌和乳腺癌等多種腫瘤發(fā)生,如hnRNP L與含有外顯子3的caspase-9a前體mRNA優(yōu)先結(jié)合,導(dǎo)致其降解,進而影響caspase-9 mRNA亞型的表達,最終調(diào)控非小細胞肺癌發(fā)生；在肝癌細胞中干擾hnRNPL的表達后,腫瘤細胞增殖、遷移能力顯著減低。HnRNPL參與眾多腫瘤生物學行為的調(diào)節(jié),然而迄今為止尚未有hnRNPL參與膀胱癌的生物學進程的文獻報道。我們前期工作中通過膀胱癌組織芯片的免疫組化檢測發(fā)現(xiàn)hnRNPL在膀胱癌組織中表達上調(diào),其高表達與膀胱癌進程有密切聯(lián)系。然而,目前hnRNPL在膀胱癌中的發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移中的是否也發(fā)揮同樣的功能至今仍不清楚,hnRNPL在膀胱癌中高表達,其可能的調(diào)控機制亦知之甚少。本課題擬檢測hnRNPL在膀胱癌中的表達情況,分析其表達與患者相關(guān)臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系；通過體內(nèi)外實驗對hnRNPL在膀胱癌增殖、凋亡及侵襲轉(zhuǎn)移中的功能進行研究；同時探究hnRNPL在膀胱癌中異常高表達可能的下游作用機制。本研究的開展有助于為膀胱癌生長和轉(zhuǎn)移機制提供新的實驗依據(jù)及思路；最終可為膀胱癌臨床早期診斷、治療及預(yù)后判斷提供可靠的新型分子標志物。研究方法：(1) HnRNPL在膀胱癌組織及細胞中的表達采用蛋白免疫印跡(Western blot)和熒光光定量PCR檢測hnRNPL在膀胱癌組織和癌旁非腫瘤組織中的表達,檢測hnRNPL在正常膀胱移行上皮細胞SV-HUC-1及膀胱癌細胞UM-UC-3、EJ、T24、5637中的表達；(2) HnRNPL在膀胱癌組織表達及其與患者臨床參數(shù)之間相關(guān)性應(yīng)用免疫組化(IHC)檢測膀胱癌石蠟樣本中hnRNPL的表達,并分析hnRNPL的表達與腫瘤的分化、分期和臨床預(yù)后等相關(guān)病理參數(shù)之間的關(guān)系；(3) HnRNPL在膀胱癌中的生物學功能建立hnRNPL穩(wěn)定干擾和過表達的膀胱癌細胞株,通過CCK-8、平板克隆形成實驗和裸鼠皮下成瘤檢測細胞增殖改變情況,利用Transwell實驗及劃痕愈合實驗檢測細胞侵襲遷移能力變化,通過流式細胞技術(shù)檢測細胞周期分布及細胞凋亡的改變；(4) HnRNPL在膀胱癌進展過程中的作用機制運用、Western blot凋亡相關(guān)蛋白caspase-3、caspase-6、caspase-9、Bcl-2、 Bcl2L1、PARP1的改變以及MAPK信號通路(p-ERK1/2、p-P38、p-JNK)及Nrf2、E2F1的激活情況。利用熒光定量PCR和Western blot檢測hnRNPL穩(wěn)定敲低和過表達后EMT標志物(E-cadherin、Vimentin、Claudin-1、ZO-1、β-catenin、 ZEB1、snail)的變化。結(jié)果：(1)膀胱癌組織中hnRNPL蛋白的表達水平檢測IHC結(jié)果顯示hnRNPL蛋白陽性表達主要定位于細胞核,呈棕黃色或棕褐色,在74.2%(115/155)的膀胱癌患者中呈陽性表達,正常膀胱組織hnRNPL蛋白表達陽性率低于其配對腫瘤組織；Western blot和qRT-PCR結(jié)果顯示膀胱癌組織中的hnRNPL蛋白及nRNA表達水平高于其配對的正常膀胱組織；(2) HnRNPL蛋白表達和臨床病理參數(shù)的關(guān)系在膀胱癌組織中,hnRNPL蛋白表達與年齡、TNM分期、臨床病理分級及組織學分級明顯相關(guān)(P0.05),而與患者的性別無明顯相關(guān)(P0.05)；Kaplan-Meier法分析顯示hnRNPL高表達組膀胱癌患者的5年生存率要顯著低于低表達組,差異具有統(tǒng)計學意義(Log rank, P0.05);多因素Cox風險比例模型分析顯示：hnRNPL是影響膀胱癌患者預(yù)后的獨立危險因素(P=0.001)；(3) HnRNPL表達對膀胱癌細胞生物學功能的影響3.1 HnRNPL穩(wěn)定干擾和過表達的膀胱癌細胞株構(gòu)建Western blot驗證結(jié)果表明慢病毒表達載體轉(zhuǎn)染后,成功構(gòu)建了hnRNPL穩(wěn)定干擾和過表達的膀胱癌細胞株；3.2 HnRNPL穩(wěn)定干擾和過表達對膀胱癌細胞增殖能力的影響CCK-8結(jié)果顯示：與對照組相比,hnRNPL穩(wěn)定干擾組的細胞生長速度顯著下降(P0.05),而過表達組細胞生長速度顯著快于對照組(P0.05)；平板克隆形成實驗結(jié)果顯示：與對照組相比,hnRNPL穩(wěn)定干擾組形成的克隆數(shù)量顯著減少(P0.05),而過表達組形成的克隆數(shù)量顯著增加(P0.05)；裸鼠皮下成瘤結(jié)果顯示：與對照組相比,hnRNPL穩(wěn)定干擾組腫瘤生長速度明顯減慢,腫瘤重量較輕(P0.05)；3.3 HnRNPL穩(wěn)定干擾和過表達對膀胱癌細胞EMT表型及遷移能力影響Western blot結(jié)果顯示在膀胱癌細胞株UM-UC-3和EJ中干擾hnRNPL的表達后上皮標志物E-cadherin的表達上調(diào),而間質(zhì)標志物Vimentin的表達下調(diào)；相反,在UM-UC-3和EJ細胞株中穩(wěn)定過表達hnRNPL后,上皮標志物E-cadherin的表達下調(diào),而間質(zhì)標志物Vimentin的表達上調(diào)；Transwell遷移實驗結(jié)果顯示：hnRNPL穩(wěn)定干擾組的細胞較對照組遷移數(shù)量明顯減少(P0.05),而hnRNPL過表達細胞株遷移數(shù)量明顯多于對照組(P0.05)。劃痕愈合實驗結(jié)果顯示：與對照組相比,hnRNPL穩(wěn)定干擾組的細胞株遷移速度明顯減慢(P0.05),而hnRNPL過表達細胞株遷移速度顯著增快(P0.05)；3.4 HnRNPL穩(wěn)定干擾和過表達對膀胱癌細胞周期分布和細胞凋亡的影響流式細胞術(shù)細胞周期檢測結(jié)果顯示：與對照組相比,hnRNPL穩(wěn)定干擾組的細胞G1期比例明顯增加,S期比例明顯減少,細胞發(fā)生G1期阻滯(P0.05),細胞周期進程明顯減慢；而hnRNPL過表達后,與對照組相比,G1期細胞比例明顯減少,S期細胞比例明顯增加(P0.05),細胞周期進程明顯加快。細胞凋亡檢測結(jié)果顯示：與對照組相比,hnRNPL穩(wěn)定干擾組的細胞凋亡比例明顯增加(P0.05),而hnRNPL過表達細胞株細胞凋亡比例顯著增加(P0.05)；3.5 HnRNPL在膀胱癌中的作用機制Western blot結(jié)果顯示膀胱癌細胞株UM-UC-3和EJ中干擾hnRNPL表達后,caspase-3、caspase-6、caspase-9、Bcl-xL表達上調(diào),而Bcl-2、PARP1的表達下調(diào)；在兩株細胞中穩(wěn)定過表達hnRNPL后,結(jié)果則相反。HnRNPL表達干擾后p-ERK1/2、p-P38、p-JNK、NRF2、E2F1表達下調(diào),在兩株細胞中穩(wěn)定過表達hnRNPL后,結(jié)果則相反；JNK在hnRNPL穩(wěn)定干擾和過表達同對照比較變化不明顯。qRT-PCR結(jié)果顯示穩(wěn)定干擾hnRNPL后E-cadherin的nRNA表達水平上調(diào),而Vimentin的mRNA表達水平下調(diào),相應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子ZEB1、ZEB2、snail、slug、mRNA表達水平均下調(diào)；Western blot結(jié)果表明干擾hnRNPL的表達后,E-cadherin, claudin-1及ZO-1表達上調(diào),而Vimentin、ZEB1, β-catenin表達下調(diào)；過表達hnRNPL后結(jié)果與之相反,且過表達后E-cadherin轉(zhuǎn)錄抑制因子snail表達水平上調(diào)。結(jié)論：(1)膀胱癌組織中hnRNPL的表達水平顯著高于癌旁非腫瘤組織,hnRNPL的表達水平與組織學分級、臨床分期、TNM分期以及預(yù)后密切相關(guān)；hnRNPL高表達患者,預(yù)后較差；(2) HnRNPL干擾可抑制膀胱癌細胞的增殖、遷移能力,抑制EMT表型轉(zhuǎn)化,誘導(dǎo)腫瘤細胞的凋亡,使細胞周期阻滯在G1期；而過表達hnRNPL可促進膀胱癌細胞EMT表型轉(zhuǎn)化、侵襲和遷移能力,抑制腫瘤細胞凋亡,使細胞周期進程加快；(3) HnRNPL可能通過調(diào)節(jié)P53/Bcl2/Caspase信號通路和IMAPK信號通路活性及E2F1等參與膀胱癌細胞的增殖、凋亡及遷移。
【關(guān)鍵詞】：膀胱癌 hnRNP L 預(yù)后 增殖 凋亡 遷移
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R737.14
【目錄】：

• 摘要3-9
• ABSTRACT9-19
• 前言19-24
• 技術(shù)路線24-25
• 第一章 HnRNP L在人膀胱癌組織中的表達及其臨床意義25-44
• 一. 材料與方法25-34
• 二. 結(jié)果34-42
• 三. 結(jié)論42
• 四. 討論42-44
• 第二章 HnRNP L基因干擾和過表達對膀胱癌細胞生物學功能的影響44-66
• 一. 材料與方法44-49
• 二. 結(jié)果49-63
• 三. 結(jié)論63
• 四. 討論63-66
• 第三章 膀胱癌中hnRNP L調(diào)控機制的初步研究66-84
• 一. 材料與方法66-71
• 二. 結(jié)果71-79
• 三. 結(jié)論79
• 四. 討論79-84
• 全文總結(jié)84-85
• 參考文獻85-95
• 在讀期間發(fā)表的論文95
• 在讀期間參與課題研究95-96
• 致謝96-97

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本文編號：485317