本文關(guān)鍵詞：雙重測(cè)序法結(jié)合芯片捕獲檢測(cè)低頻突變的方法的建立，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：液體活檢,即通過(guò)血液或者體液檢測(cè)腫瘤循環(huán)DNA(circulating tumor DNA,ctDNA),獲得腫瘤基因突變的信息,具有非侵入性、取樣方便、可持續(xù)監(jiān)測(cè)的特點(diǎn),是腫瘤個(gè)體化治療的重要工具。由于ctDNA具有的含量一般低于1%,并且腫瘤呈現(xiàn)高度異質(zhì)性,而新一代測(cè)序技術(shù)存在約1%的錯(cuò)誤率,使突變信息難以被準(zhǔn)確檢測(cè)到。雙重測(cè)序法利用文庫(kù)片段兩端的隨機(jī)標(biāo)簽組合去除測(cè)序錯(cuò)誤,可以將測(cè)序準(zhǔn)確度提高10000倍以上。因此本文利用6個(gè)已知突變頻率的尿液來(lái)驗(yàn)證雙重測(cè)序法結(jié)合芯片捕獲技術(shù)的靈敏度,并用1例膀胱癌手術(shù)前后的尿液樣本來(lái)證明該方法在腫瘤液體活檢的可行性。本文探討研究了雙重測(cè)序法結(jié)合芯片捕獲技術(shù)的靈敏度,以及方法在真實(shí)樣本檢測(cè)中的可行性。方法的靈敏度:在正常人尿液提取的DNA中加入1%,0.1%,0.01%的胃癌823細(xì)胞系DNA(擁有90個(gè)已知的突變位點(diǎn))作為模擬樣本,通過(guò)雙重測(cè)序法和包含胃癌細(xì)胞系DNA 90個(gè)突變的芯片來(lái)建庫(kù)捕獲,檢測(cè)混合樣品里的突變位點(diǎn)。檢測(cè)膀胱癌突變的可行性:用雙重測(cè)序法結(jié)合芯片捕獲技術(shù)對(duì)1例膀胱癌患者術(shù)前和術(shù)后的尿液DNA,一個(gè)正常人的尿液DNA進(jìn)行檢測(cè),比較3個(gè)樣品的基因突變情況。靈敏度測(cè)試的結(jié)果顯示,在3個(gè)梯度的突變率中均能檢測(cè)出突變,測(cè)序深度達(dá)到8000x時(shí),含1%突變的樣本的真實(shí)突變檢出率大于66%,準(zhǔn)確率大于93%。該方法用于檢測(cè)膀胱癌突變時(shí),芯片捕獲率約60%,在病人術(shù)前、術(shù)后和正常人的尿液DNA中分別找到了39個(gè),1個(gè)和4個(gè)突變位點(diǎn)。本研究說(shuō)明,雙重測(cè)序法是一個(gè)能夠檢測(cè)到0.01%低頻突變的方法,結(jié)合芯片捕獲技術(shù),可特異性地檢測(cè)膀胱癌尿液樣本中疾病相關(guān)的基因突變位點(diǎn)。雙重測(cè)序結(jié)合芯片捕獲技術(shù)檢測(cè)低頻突變,是一個(gè)有發(fā)展?jié)摿Σ⑶冶容^新的方法,需要更多的樣本和數(shù)據(jù)支持,讓它可以更好更廣泛地應(yīng)有。
【關(guān)鍵詞】：腫瘤循環(huán)DNA 低頻突變 雙重測(cè)序 芯片捕獲
【學(xué)位授予單位】：華南理工大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：R73-3
【目錄】：

• 摘要5-6
• ABSTRACT6-9
• 第一章 緒論9-27
• 1.1 前言9
• 1.2 腫瘤與基因突變的概述9-13
• 1.2.1 腫瘤基因突變檢測(cè)的進(jìn)展10-12
• 1.2.2 腫瘤個(gè)性化治療的發(fā)展12-13
• 1.3 無(wú)創(chuàng)腫瘤基因檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展13-16
• 1.3.1 血液ctDNA無(wú)創(chuàng)檢測(cè)技術(shù)13-15
• 1.3.2 糞便和尿液無(wú)創(chuàng)檢測(cè)技術(shù)15-16
• 1.4 低頻檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展16-18
• 1.4.1 COLD-PCR技術(shù)16-17
• 1.4.2 Digital PCR技術(shù)17
• 1.4.3 高分辨率熔解曲線(xiàn)分析技術(shù)17-18
• 1.5 本課題研究背景和研究?jī)?nèi)容18-27
• 1.5.1 研究背景18
• 1.5.2 研究?jī)?nèi)容18-25
• 1.5.3 研究方案25-27
• 第二章 靈敏度測(cè)試27-43
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料27-29
• 2.1.1 樣品27
• 2.1.2 主要儀器設(shè)備27-28
• 2.1.3 主要試劑28
• 2.1.4 主要耗材28-29
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法29-36
• 2.2.1 提取尿液基因組DNA29-30
• 2.2.2 樣品檢測(cè)30
• 2.2.3 芯片設(shè)計(jì)30
• 2.2.4 文庫(kù)構(gòu)建30-34
• 2.2.5 測(cè)序34
• 2.2.6 下機(jī)數(shù)據(jù)處理34-36
• 2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果36-40
• 2.4 討論40-43
• 第三章 臨床可行性測(cè)試43-57
• 3.1 實(shí)驗(yàn)材料43
• 3.1.1 樣品43
• 3.1.2 主要儀器設(shè)備43
• 3.1.3 主要試劑43
• 3.1.4 主要耗材43
• 3.2 實(shí)驗(yàn)方法43-46
• 3.2.1 接頭退火方法的比較43-45
• 3.2.2 臨床樣品的檢測(cè)應(yīng)用45-46
• 3.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果46-52
• 3.3.1 不同接頭退火方法的比較46-50
• 3.3.2 臨床樣品的檢測(cè)應(yīng)用50-52
• 3.4 討論52-57
• 結(jié)論57-58
• 參考文獻(xiàn)58-63
• 附錄63-67
• 致謝67-68
• 附件68

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