本文關(guān)鍵詞：eIF4E在人非小細(xì)胞肺癌中的作用及其對Pim-1表達(dá)調(diào)控的實(shí)驗(yàn)研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的:在全球范圍內(nèi),肺癌的發(fā)病率及死亡率位于常見惡性腫瘤的前列,揭示其病因及發(fā)病機(jī)制對于肺癌的有效治療意義重大。我們前期研究表明,Pim-1在非小細(xì)胞肺癌組織(Non-small-cell lung cancer,NSCLC)中過表達(dá),并且其過表達(dá)可以促進(jìn)NSCLC細(xì)胞的增殖以及腫瘤遷移等過程,發(fā)揮癌基因的作用。但是,目前有關(guān)Pim-1在NSCLC中過表達(dá)的機(jī)制尚不清楚。真核細(xì)胞翻譯起始因子4E(e IF4E)作為重要的真核細(xì)胞翻譯起始因子,可增加一些癌基因在蛋白水平的合成過程。e IF4E是否參與NSCLC中Pim-1的表達(dá)調(diào)控尚不清楚。鑒于此,本實(shí)驗(yàn)旨在研究e IF4E在NSCLC中的表達(dá)及作用,同時分析e IF4E對Pim-1表達(dá)的調(diào)控作用。方法:1免疫組織化學(xué)方法采用免疫組織化學(xué)ElivisionTMplus三步法,檢測Pim-1與e IF4E蛋白在福爾馬林固定石蠟包埋NSCLC組織中的表達(dá)。在此基礎(chǔ)上,分析Pim-1與e IF4E表達(dá)與臨床病理學(xué)特征的相關(guān)性,并對二者表達(dá)的相關(guān)性進(jìn)行分析。2細(xì)胞培養(yǎng)人肺癌細(xì)胞H1299、A549、H157、H460和H358,培養(yǎng)于含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 U/ml鏈霉素的1640培養(yǎng)基中,37℃、5%CO2培養(yǎng),細(xì)胞貼壁生長。取對數(shù)生長期的培養(yǎng)細(xì)胞,用0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA消化,進(jìn)行細(xì)胞傳代以及細(xì)胞的收集,進(jìn)行相關(guān)研究。3 si RNA轉(zhuǎn)染使用100 pmol e IF4E特異性si RNA瞬時轉(zhuǎn)染H1299和A549細(xì)胞,同時轉(zhuǎn)染Negtive control si RNA(NC si RNA)作為陰性對照。體外觀察e IF4E在NSCLC中的作用及對Pim-1的表達(dá)的影響。4 MTT比色法分別于e IF4E si RNA轉(zhuǎn)染后0h、24 h、48h、72h和96h,采用MTT方法檢測對H1299及A549細(xì)胞的生長情況;不同濃度吉非替尼處理48h后進(jìn)行MTT檢測,繪制細(xì)胞生長曲線并計(jì)算半數(shù)抑制濃度(IC50)。此外,分別于Pim-1 si RNA或e IF4E si RNA轉(zhuǎn)染聯(lián)合吉非替尼(gefitinib)處理細(xì)胞后進(jìn)行MTT檢測。5蛋白免疫印跡(Western blot)e IF4E si RNA轉(zhuǎn)染H1299、A549細(xì)胞48h后提取細(xì)胞總蛋白,采用蛋白免疫印跡方法檢測e IF4E si RNA轉(zhuǎn)染后e IF4E和Pim-1蛋白表達(dá)情況,并計(jì)算其相對表達(dá)量。采用Odyssey儀器進(jìn)行顯色分析,Bio-LD圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行定量分析。6 Real-time PCR轉(zhuǎn)染處理H1299和A549細(xì)胞48h后,應(yīng)用Real-time PCR方法檢測細(xì)胞中Pim-1和e IF4E m RNA的表達(dá)情況。采用Applied Biosystems公司提供的Comparative Ct(ΔΔCt)方法計(jì)算,計(jì)算目的基因的相對表達(dá)量。7統(tǒng)計(jì)應(yīng)用SPSS Statistics17.0軟件,數(shù)據(jù)分析采用兩樣本t檢驗(yàn)、χ2檢驗(yàn)、spearman等級相關(guān)分析及曲線擬合;計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±SD)表示。P0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果:1 e IF4E蛋白在NSCLC組織中的表達(dá)及與臨床病理特征的關(guān)系免疫組織化學(xué)染色結(jié)果表明,e IF4E蛋白的陽性著色定位于腫瘤細(xì)胞的胞漿中。在69例NSCLC石蠟組織中有56例呈陽性表達(dá),陽性表達(dá)率為81.1%(56/69)。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn),e IF4E蛋白的表達(dá)與腫瘤大小密切相關(guān)(P=0.036),但是與其他重要臨床病理特征無顯著相關(guān)性(P0.05)。2 e IF4E si RNA轉(zhuǎn)染對NSCLC細(xì)胞生長與遷移的影響體外培養(yǎng)A549和H1299細(xì)胞,將e IF4E si RNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞后,從細(xì)胞生長與遷移方面觀察e IF4E在NSCLC中可能的作用。2.1 e IF4E si RNA干擾效率的檢測我們選取e IF4E蛋白高表達(dá)的A549和H1299細(xì)胞進(jìn)行e IF4E si RNA干擾實(shí)驗(yàn),于轉(zhuǎn)染后48小時收集細(xì)胞進(jìn)行干擾效率的檢測。Real-time PCR結(jié)果顯示,與NC si RNA對照組相比,e IF4E m RNA的表達(dá)在A549細(xì)胞和H1299細(xì)胞e IF4E si RNA轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中分別降低了83%和80%。Western blot檢測結(jié)果同樣表明,e IF4E蛋白的表達(dá)在e IF4Esi RNA轉(zhuǎn)染組明顯低于對照組。上述結(jié)果表明,所用e IF4E si RNA序列可以有效干擾e IF4E的表達(dá)。2.2 e IF4E si RNA轉(zhuǎn)染對細(xì)胞生長作用的影響MTT檢測結(jié)果表明,A549及H1299細(xì)胞的存活率在e IF4E si RNA轉(zhuǎn)染后48h、72h和96h時均明顯低于對照組(P0.05),并且隨著時間增加抑制細(xì)胞生長的作用越明顯。結(jié)果提示,敲低e IF4E表達(dá)可抑制A549和H1299細(xì)胞的生長。2.3 e IF4E si RNA轉(zhuǎn)染對細(xì)胞遷移力的影響細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,于劃痕后48h,可見e IF4E si RNA轉(zhuǎn)染組A549和H1299細(xì)胞朝向劃痕遷移的速度明顯低于對照組細(xì)胞。結(jié)果表明敲低e IF4E表達(dá)可抑制細(xì)胞的遷移能力。3 e IF4E對體外培養(yǎng)A549和H1299細(xì)胞Pim-1表達(dá)的影響為進(jìn)一步探討e IF4E對Pim-1在肺癌中表達(dá)的作用,我們采用si RNA干擾技術(shù),將e IF4E si RNA轉(zhuǎn)染A549和H1299細(xì)胞,從RNA和蛋白水平上對二者表達(dá)的關(guān)系進(jìn)行研究。Real-time PCR結(jié)果顯示,與NC si RNA對照組相比,e IF4E si RNA轉(zhuǎn)染組A549和H1299細(xì)胞中Pim-1在m RNA水平的表達(dá)無顯著變化。但是,Western blot檢測結(jié)果表明,Pim-1蛋白的表達(dá)在e IF4E si RNA轉(zhuǎn)染組明顯低于對照組,尤其A549細(xì)胞下降更為明顯。結(jié)果提示,敲低e IF4E表達(dá)可顯著抑制細(xì)胞中Pim-1蛋白的表達(dá)。4 e IF4E與Pim-1蛋白在NSCLC組織中表達(dá)的相關(guān)性分析4.1 Pim-1蛋白在NSCLC組織中的表達(dá)及與臨床病理特征的關(guān)系免疫組織化學(xué)染色結(jié)果表明,Pim-1蛋白的陽性著色部位定位于腫瘤細(xì)胞胞核和(或)胞漿。在77例NSCLC組織中有51例陽性表達(dá),陽性表達(dá)率為66.2%(51/77),21例正常肺組織中僅有3例陽性表達(dá),陽性表達(dá)率為14.3%(3/21),表明腫瘤組織中Pim-1蛋白的表達(dá)顯著高于正常組織(P0.001)。并且Pim-1蛋白的表達(dá)和腫瘤組織學(xué)類型、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移和臨床分期密切相關(guān)(P0.05)。4.2 Pim-1蛋白和e IF4E蛋白表達(dá)的相關(guān)性分析在69例NSCLC標(biāo)本中,Pim-1和e IF4E共同陽性例數(shù)有43例,共同陰性有11例。利用spearman等級相關(guān)分析(Spearman’s rank test)發(fā)現(xiàn),二者表達(dá)具有顯著的正性相關(guān)關(guān)系(r=0.504,P0.001)。5 e IF4E/Pim-1 si RNA轉(zhuǎn)染聯(lián)合gefitinib處理對A549和H1299細(xì)胞生長的影響5.1繪制gefitinib對A549和H1299細(xì)胞的生長曲線采用MTT檢測并利用曲線擬合(curve fitting)繪制細(xì)胞生長曲線,計(jì)算半數(shù)抑制濃度(IC50)值確定gefitinib最適的作用濃度。結(jié)果表明,gefitinib對H1299、A549細(xì)胞的IC50分別為20.17μM和10.56μM,所以我們分別用20μM和10μM處理H1299和A549細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。5.2 e IF4E si RNA轉(zhuǎn)染聯(lián)合gefitinib處理對細(xì)胞生長的影響MTT檢測結(jié)果表明,A549細(xì)胞給予e IF4E si RNA聯(lián)合gefitinib處理后72小時,可見細(xì)胞存活率顯著低于NC si RNA聯(lián)合gefitinib處理組細(xì)胞(P0.05)。此外,給予H1299細(xì)胞e IF4E si RNA聯(lián)合gefitinib處理后48h和72h,均可見細(xì)胞存活率顯著低于NC si RNA聯(lián)合gefitinib處理組(P0.05)。上述結(jié)果提示e IF4E si RNA轉(zhuǎn)染可以增加腫瘤細(xì)胞對靶向治療藥物gefitinib的敏感性。5.3 Pim-1 si RNA轉(zhuǎn)染聯(lián)合gefitinib處理對細(xì)胞生長的影響MTT檢測結(jié)果表明,A549細(xì)胞給予Pim-1 si RNA聯(lián)合gefitinib處理后48h和72小時,可見細(xì)胞細(xì)胞存活率顯著低于NC si RNA聯(lián)合gefitinib處理組細(xì)胞(P0.05)。此外,給予H1299細(xì)胞給予Pim-1 si RNA聯(lián)合gefitinib處理72h,均可見細(xì)胞存活率顯著低于NC si RNA聯(lián)合gefitinib處理組(P0.05)。上述結(jié)果提示Pim-1 si RNA轉(zhuǎn)染可以增加腫瘤細(xì)胞對gefitinib的敏感性。結(jié)論:1 e IF4E蛋白在人非小細(xì)胞肺癌組織中呈高表達(dá),并且其表達(dá)與腫瘤大小顯著相關(guān)。體外敲低e IF4E表達(dá)可顯著抑制A549和H1299細(xì)胞的生長與遷移能力。2 Pim-1蛋白在人非小細(xì)胞肺癌常表現(xiàn)為過表達(dá),并且與腫瘤的組織學(xué)類型、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移及臨床分期相關(guān)。3 e IF4E與Pim-1蛋白在NSCLC中的表達(dá)呈顯著正性相關(guān)關(guān)系,且體外實(shí)驗(yàn)表明e IF4E可在蛋白水平調(diào)節(jié)Pim-1的表達(dá)。4 si RNA轉(zhuǎn)染抑制Pim-1或e IF4E的表達(dá)可以增加A549和H1299細(xì)胞對EGFR-TKI gefitinib的敏感性。
【關(guān)鍵詞】：Pim-1 eIF4E NSCLC siRNA轉(zhuǎn)染 A549細(xì)胞 H1299細(xì)胞 gefitinib
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R734.2
【目錄】：

• 中文摘要4-9
• 英文摘要9-15
• 英文縮寫15-16
• 前言16-17
• 材料與方法17-25
• 結(jié)果25-30
• 附圖30-40
• 附表40-47
• 討論47-50
• 結(jié)論50-51
• 參考文獻(xiàn)51-53
• 綜述 eIF4E在腫瘤中的表達(dá)和研究進(jìn)展53-63
• 參考文獻(xiàn)58-63
• 致謝63-64
• 個人簡歷64

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本文編號：484891