本文關鍵詞：eIF4E在人非小細胞肺癌中的作用及其對Pim-1表達調控的實驗研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的:在全球范圍內,肺癌的發(fā)病率及死亡率位于常見惡性腫瘤的前列,揭示其病因及發(fā)病機制對于肺癌的有效治療意義重大。我們前期研究表明,Pim-1在非小細胞肺癌組織(Non-small-cell lung cancer,NSCLC)中過表達,并且其過表達可以促進NSCLC細胞的增殖以及腫瘤遷移等過程,發(fā)揮癌基因的作用。但是,目前有關Pim-1在NSCLC中過表達的機制尚不清楚。真核細胞翻譯起始因子4E(e IF4E)作為重要的真核細胞翻譯起始因子,可增加一些癌基因在蛋白水平的合成過程。e IF4E是否參與NSCLC中Pim-1的表達調控尚不清楚。鑒于此,本實驗旨在研究e IF4E在NSCLC中的表達及作用,同時分析e IF4E對Pim-1表達的調控作用。方法:1免疫組織化學方法采用免疫組織化學ElivisionTMplus三步法,檢測Pim-1與e IF4E蛋白在福爾馬林固定石蠟包埋NSCLC組織中的表達。在此基礎上,分析Pim-1與e IF4E表達與臨床病理學特征的相關性,并對二者表達的相關性進行分析。2細胞培養(yǎng)人肺癌細胞H1299、A549、H157、H460和H358,培養(yǎng)于含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 U/ml鏈霉素的1640培養(yǎng)基中,37℃、5%CO2培養(yǎng),細胞貼壁生長。取對數生長期的培養(yǎng)細胞,用0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA消化,進行細胞傳代以及細胞的收集,進行相關研究。3 si RNA轉染使用100 pmol e IF4E特異性si RNA瞬時轉染H1299和A549細胞,同時轉染Negtive control si RNA(NC si RNA)作為陰性對照。體外觀察e IF4E在NSCLC中的作用及對Pim-1的表達的影響。4 MTT比色法分別于e IF4E si RNA轉染后0h、24 h、48h、72h和96h,采用MTT方法檢測對H1299及A549細胞的生長情況;不同濃度吉非替尼處理48h后進行MTT檢測,繪制細胞生長曲線并計算半數抑制濃度(IC50)。此外,分別于Pim-1 si RNA或e IF4E si RNA轉染聯(lián)合吉非替尼(gefitinib)處理細胞后進行MTT檢測。5蛋白免疫印跡(Western blot)e IF4E si RNA轉染H1299、A549細胞48h后提取細胞總蛋白,采用蛋白免疫印跡方法檢測e IF4E si RNA轉染后e IF4E和Pim-1蛋白表達情況,并計算其相對表達量。采用Odyssey儀器進行顯色分析,Bio-LD圖像分析系統(tǒng)進行定量分析。6 Real-time PCR轉染處理H1299和A549細胞48h后,應用Real-time PCR方法檢測細胞中Pim-1和e IF4E m RNA的表達情況。采用Applied Biosystems公司提供的Comparative Ct(ΔΔCt)方法計算,計算目的基因的相對表達量。7統(tǒng)計應用SPSS Statistics17.0軟件,數據分析采用兩樣本t檢驗、χ2檢驗、spearman等級相關分析及曲線擬合;計量資料以均數±標準差(x±SD)表示。P0.05認為差異具有統(tǒng)計學意義。結果:1 e IF4E蛋白在NSCLC組織中的表達及與臨床病理特征的關系免疫組織化學染色結果表明,e IF4E蛋白的陽性著色定位于腫瘤細胞的胞漿中。在69例NSCLC石蠟組織中有56例呈陽性表達,陽性表達率為81.1%(56/69)。進一步分析發(fā)現,e IF4E蛋白的表達與腫瘤大小密切相關(P=0.036),但是與其他重要臨床病理特征無顯著相關性(P0.05)。2 e IF4E si RNA轉染對NSCLC細胞生長與遷移的影響體外培養(yǎng)A549和H1299細胞,將e IF4E si RNA轉染細胞后,從細胞生長與遷移方面觀察e IF4E在NSCLC中可能的作用。2.1 e IF4E si RNA干擾效率的檢測我們選取e IF4E蛋白高表達的A549和H1299細胞進行e IF4E si RNA干擾實驗,于轉染后48小時收集細胞進行干擾效率的檢測。Real-time PCR結果顯示,與NC si RNA對照組相比,e IF4E m RNA的表達在A549細胞和H1299細胞e IF4E si RNA轉染組細胞中分別降低了83%和80%。Western blot檢測結果同樣表明,e IF4E蛋白的表達在e IF4Esi RNA轉染組明顯低于對照組。上述結果表明,所用e IF4E si RNA序列可以有效干擾e IF4E的表達。2.2 e IF4E si RNA轉染對細胞生長作用的影響MTT檢測結果表明,A549及H1299細胞的存活率在e IF4E si RNA轉染后48h、72h和96h時均明顯低于對照組(P0.05),并且隨著時間增加抑制細胞生長的作用越明顯。結果提示,敲低e IF4E表達可抑制A549和H1299細胞的生長。2.3 e IF4E si RNA轉染對細胞遷移力的影響細胞劃痕實驗結果表明,于劃痕后48h,可見e IF4E si RNA轉染組A549和H1299細胞朝向劃痕遷移的速度明顯低于對照組細胞。結果表明敲低e IF4E表達可抑制細胞的遷移能力。3 e IF4E對體外培養(yǎng)A549和H1299細胞Pim-1表達的影響為進一步探討e IF4E對Pim-1在肺癌中表達的作用,我們采用si RNA干擾技術,將e IF4E si RNA轉染A549和H1299細胞,從RNA和蛋白水平上對二者表達的關系進行研究。Real-time PCR結果顯示,與NC si RNA對照組相比,e IF4E si RNA轉染組A549和H1299細胞中Pim-1在m RNA水平的表達無顯著變化。但是,Western blot檢測結果表明,Pim-1蛋白的表達在e IF4E si RNA轉染組明顯低于對照組,尤其A549細胞下降更為明顯。結果提示,敲低e IF4E表達可顯著抑制細胞中Pim-1蛋白的表達。4 e IF4E與Pim-1蛋白在NSCLC組織中表達的相關性分析4.1 Pim-1蛋白在NSCLC組織中的表達及與臨床病理特征的關系免疫組織化學染色結果表明,Pim-1蛋白的陽性著色部位定位于腫瘤細胞胞核和(或)胞漿。在77例NSCLC組織中有51例陽性表達,陽性表達率為66.2%(51/77),21例正常肺組織中僅有3例陽性表達,陽性表達率為14.3%(3/21),表明腫瘤組織中Pim-1蛋白的表達顯著高于正常組織(P0.001)。并且Pim-1蛋白的表達和腫瘤組織學類型、腫瘤大小、淋巴結轉移、遠端轉移和臨床分期密切相關(P0.05)。4.2 Pim-1蛋白和e IF4E蛋白表達的相關性分析在69例NSCLC標本中,Pim-1和e IF4E共同陽性例數有43例,共同陰性有11例。利用spearman等級相關分析(Spearman’s rank test)發(fā)現,二者表達具有顯著的正性相關關系(r=0.504,P0.001)。5 e IF4E/Pim-1 si RNA轉染聯(lián)合gefitinib處理對A549和H1299細胞生長的影響5.1繪制gefitinib對A549和H1299細胞的生長曲線采用MTT檢測并利用曲線擬合(curve fitting)繪制細胞生長曲線,計算半數抑制濃度(IC50)值確定gefitinib最適的作用濃度。結果表明,gefitinib對H1299、A549細胞的IC50分別為20.17μM和10.56μM,所以我們分別用20μM和10μM處理H1299和A549細胞進行后續(xù)實驗。5.2 e IF4E si RNA轉染聯(lián)合gefitinib處理對細胞生長的影響MTT檢測結果表明,A549細胞給予e IF4E si RNA聯(lián)合gefitinib處理后72小時,可見細胞存活率顯著低于NC si RNA聯(lián)合gefitinib處理組細胞(P0.05)。此外,給予H1299細胞e IF4E si RNA聯(lián)合gefitinib處理后48h和72h,均可見細胞存活率顯著低于NC si RNA聯(lián)合gefitinib處理組(P0.05)。上述結果提示e IF4E si RNA轉染可以增加腫瘤細胞對靶向治療藥物gefitinib的敏感性。5.3 Pim-1 si RNA轉染聯(lián)合gefitinib處理對細胞生長的影響MTT檢測結果表明,A549細胞給予Pim-1 si RNA聯(lián)合gefitinib處理后48h和72小時,可見細胞細胞存活率顯著低于NC si RNA聯(lián)合gefitinib處理組細胞(P0.05)。此外,給予H1299細胞給予Pim-1 si RNA聯(lián)合gefitinib處理72h,均可見細胞存活率顯著低于NC si RNA聯(lián)合gefitinib處理組(P0.05)。上述結果提示Pim-1 si RNA轉染可以增加腫瘤細胞對gefitinib的敏感性。結論:1 e IF4E蛋白在人非小細胞肺癌組織中呈高表達,并且其表達與腫瘤大小顯著相關。體外敲低e IF4E表達可顯著抑制A549和H1299細胞的生長與遷移能力。2 Pim-1蛋白在人非小細胞肺癌常表現為過表達,并且與腫瘤的組織學類型、腫瘤大小、淋巴結轉移、遠端轉移及臨床分期相關。3 e IF4E與Pim-1蛋白在NSCLC中的表達呈顯著正性相關關系,且體外實驗表明e IF4E可在蛋白水平調節(jié)Pim-1的表達。4 si RNA轉染抑制Pim-1或e IF4E的表達可以增加A549和H1299細胞對EGFR-TKI gefitinib的敏感性。
【關鍵詞】：Pim-1 eIF4E NSCLC siRNA轉染 A549細胞 H1299細胞 gefitinib
【學位授予單位】：河北醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R734.2
【目錄】：

• 中文摘要4-9
• 英文摘要9-15
• 英文縮寫15-16
• 前言16-17
• 材料與方法17-25
• 結果25-30
• 附圖30-40
• 附表40-47
• 討論47-50
• 結論50-51
• 參考文獻51-53
• 綜述 eIF4E在腫瘤中的表達和研究進展53-63
• 參考文獻58-63
• 致謝63-64
• 個人簡歷64

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