本文關(guān)鍵詞：靶向CD19的嵌合抗原受體修飾的T細(xì)胞（CD19-CAR-T）的構(gòu)建及其對(duì)CD19陽(yáng)性血液腫瘤細(xì)胞的殺傷研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：研究目的隨著基因編輯技術(shù)的逐步發(fā)展,過(guò)繼性免疫治療(Adoptive cellular therapy,ACT)在腫瘤生物治療中占據(jù)著越來(lái)越重要的作用。由于諸多限制,以往的過(guò)繼免疫治療并未產(chǎn)生持續(xù)、明顯的抗瘤作用。但是一種新的過(guò)繼性免疫療法--嵌合抗原受體(chimeric antigen receptor,CAR)的發(fā)展極大的增強(qiáng)了過(guò)繼性免疫治療的治療效果,其突出優(yōu)點(diǎn)是可以克服MHC限制性。CD19抗原特異性表達(dá)于B淋巴細(xì)胞及B系血液腫瘤細(xì)胞表面,在正常的造血干細(xì)胞表面不表達(dá),是CAR-T治療B系血液腫瘤的研究熱點(diǎn)。本課題以pc DNA?3.1(+)為質(zhì)粒載體,使用小鼠抗人CD19單抗(克隆號(hào):FMC63)為胞外單克隆抗體單鏈可變區(qū)序列,以CD137為共刺激分子,T細(xì)胞受體(TCR)/CD3的-δ鏈作為胞內(nèi)信號(hào)結(jié)構(gòu)域來(lái)構(gòu)建第二代嵌合抗原受體。同時(shí)采用不同培養(yǎng)方法來(lái)培養(yǎng)構(gòu)建的CAR-T細(xì)胞,觀察不同培養(yǎng)條件下的構(gòu)建CAR-T表達(dá)效率,然后使用培養(yǎng)的CD19-CAR-T細(xì)胞殺傷CD19陽(yáng)性血液腫瘤細(xì)胞及對(duì)照細(xì)胞,觀察殺傷性細(xì)胞因子的分泌及其靶向性殺傷作用,對(duì)CAR-T細(xì)胞在體內(nèi)外抗CD19陽(yáng)性血液腫瘤的作用進(jìn)行初步研究。研究方法確定CD19單抗的單鏈可變區(qū)片段、CD137共刺激分子及CD3-δ鏈序列,使用基因工程方法將其整合成一個(gè)整體序列,即CD19-CAR。然后將CD19-CAR片段克隆到慢病毒載體pc DNA?3.1(+)上,選用的插入酶切位點(diǎn)是Nhe I/Bam HI。然后將穿梭質(zhì)粒和包裝質(zhì)粒(p Gag/Pol、p Rev、p VSV-G)和pc DNA?3.1(+)目的質(zhì)粒共培養(yǎng)并轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,制備成慢病毒,使用DNA測(cè)序及流式檢測(cè)構(gòu)建慢病毒序列是否正確。進(jìn)而使用慢病毒對(duì)活化T細(xì)胞進(jìn)行感染,使用加有IL-15或不加IL-15的無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)CD19-CAR-T細(xì)胞,利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD19-CAR-T細(xì)胞的生長(zhǎng)表達(dá)情況、細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子的表達(dá)。結(jié)果DNA測(cè)序表明慢病毒基因序列構(gòu)建正確,通過(guò)熒光顯微鏡及稀釋倍數(shù)測(cè)定制備的慢病毒滴度約為2×108TU/ml。轉(zhuǎn)染慢病毒后(本身表達(dá)EGFP)的T細(xì)胞加Fc-APC抗體檢測(cè),EGFP熒光/Fc-APC雙陽(yáng)性,流式結(jié)果表明CD19-CAR-構(gòu)建成功可以在細(xì)胞膜表面表達(dá)。加入低濃度的IL-15的CAR-T表達(dá)率為45%,未加入IL-15的CAR-T表達(dá)率為9%。CD19-CAR-T細(xì)胞與293T細(xì)胞共培養(yǎng)后IL-2、TNF-α殺傷細(xì)胞因子分泌量分別為1.89%和0.2%,CD19-CAR-T細(xì)胞與CD19-K562共培養(yǎng)后上述2種細(xì)胞因子的分泌量分別為30.1%和32.49%。結(jié)論CD19-CAR序列構(gòu)建正確并成功表達(dá),低濃度的IL-15可以促進(jìn)CAR-T細(xì)胞的生長(zhǎng)及其表達(dá),轉(zhuǎn)染后的CAR-T細(xì)胞可以靶向性識(shí)別CD19陽(yáng)性的靶細(xì)胞并引起IL-2、TNF-α細(xì)胞因子大量釋放,為CAR-T用于臨床治療提供部分實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：嵌合抗原受體T細(xì)胞 慢病毒 CD19抗原 細(xì)胞因子
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：R733
【目錄】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-9
• 引言9-13
• 材料和方法13-19
• 1.實(shí)驗(yàn)材料13-14
• 2. 實(shí)驗(yàn)方法與步驟14-19
• 結(jié)果19-23
• 1. CD19-CAR重組質(zhì)粒構(gòu)建結(jié)果19
• 2. 重組質(zhì)粒中CD19基因片段序列鑒定19-20
• 3. 慢病毒包裝、滴度測(cè)定結(jié)果20
• 4. 流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD19-CAR在T細(xì)胞表面的表達(dá)20-21
• 5. 流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD19-CAR在T細(xì)胞表面的表達(dá)及細(xì)胞內(nèi)某些細(xì)胞因子的表達(dá)21-23
• 討論23-26
• 參考文獻(xiàn)26-29
• 綜述 嵌合抗原受體療法在惡性血液病免疫治療中的進(jìn)展29-41
• 參考文獻(xiàn)37-41
• 中英文對(duì)照縮略詞表41-42
• 攻讀學(xué)位期間已完成的工作42-43
• 致謝43-44

【相似文獻(xiàn)】

中國(guó)碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 王強(qiáng)力;靶向CD19的嵌合抗原受體修飾的T細(xì)胞（CD19-CAR-T）的構(gòu)建及其對(duì)CD19陽(yáng)性血液腫瘤細(xì)胞的殺傷研究[D];蘇州大學(xué);2016年

  本文關(guān)鍵詞：靶向CD19的嵌合抗原受體修飾的T細(xì)胞（CD19-CAR-T）的構(gòu)建及其對(duì)CD19陽(yáng)性血液腫瘤細(xì)胞的殺傷研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號(hào)：484654