本文關(guān)鍵詞：NDV7793對小鼠肝癌皮下移植瘤的抑制作用，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：研究背景和目的生物免疫療法因具有對患者創(chuàng)傷及毒副作用小、效率高、對多發(fā)病灶或轉(zhuǎn)移的惡性腫瘤同樣有效、遠(yuǎn)期抗癌效果良好等優(yōu)點(diǎn),成為癌癥治療的研究熱點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn),病毒除了對腫瘤的特異性殺傷作用外,還能夠激活宿主機(jī)體免疫系統(tǒng)對腫瘤的免疫應(yīng)答,因此溶瘤病毒療法成為一種新的生物免疫治療方法。到目前為止,NDV作為單股負(fù)鏈RNA的副粘病毒,其抗腫瘤效果的基礎(chǔ)研究發(fā)現(xiàn),NDV不僅能夠直接特異性殺傷腫瘤細(xì)胞,而且其通過對宿主免疫系統(tǒng)的刺激,抗腫瘤效果也很顯著。我們課題組利用分離自江西鄱陽湖野鴨的NDV野生弱毒株(命名為WDK/JX/7793/2004,簡稱NDV7793)進(jìn)行抗瘤的基礎(chǔ)研究,證實(shí)NDV7793不僅能在體外激活NK細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞,還能在體內(nèi)能通過TRAIL在內(nèi)的多種途徑增強(qiáng)NK細(xì)胞對肝癌細(xì)胞的殺傷活性。本課題旨在研究NDV7793對小鼠肝癌皮下移植瘤的抑制作用,探討NDV7793對小鼠肝癌皮下移植瘤瘤內(nèi)腫瘤浸潤性淋巴細(xì)胞(Tumor-infiltrating lymphocytes, TIL)免疫功能的影響,為NDV7793作為生物免疫治療劑應(yīng)用于臨床實(shí)踐提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。研究內(nèi)容和方法1.NDV7793對小鼠肝癌皮下移植瘤的抑制常規(guī)培養(yǎng)小鼠肝癌H22細(xì)胞,將約1×106個(gè)小鼠肝癌H22細(xì)胞注射至小鼠右側(cè)腋下,建立小鼠肝癌皮下移植瘤模型。小鼠肝癌皮下移植瘤模型建立成功后,給予擴(kuò)增及純化后的NDV7793瘤內(nèi)注射,連續(xù)給藥天數(shù)分別為Id、2d、3d、4d、5d、6d和7d后,PBS同樣連續(xù)給藥作為對照組,通過對其生存期及瘤內(nèi)TIL中CD4+CD25+CD127、low調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)、CD8+T細(xì)胞比例的檢測選擇NDV7793最佳給藥天數(shù)。根據(jù)最佳給藥天數(shù)給藥：小鼠肝癌皮下移植瘤模型建立成功的80只荷瘤小鼠隨機(jī)分成PBS陰性對照組、IL-2陽性對照組、流感病毒(FLU)對照組、NDV7793給藥組,各組均為20只,瘤內(nèi)注射給藥,0.1mL/只,從建模成功后開始連續(xù)給藥4天。每組隨機(jī)選取10只小鼠,對各組小鼠進(jìn)行生存分析。剩余小鼠于停藥24h后處死,剝?nèi)∧[瘤組織稱重,計(jì)算抑瘤率。2.NDV7793對小鼠肝癌皮下移植瘤內(nèi)TIL免疫功能的影響無菌剝?nèi)〉哪[瘤組織研磨后用Percoll梯度離心法獲取TIL,得到的TIL細(xì)胞計(jì)數(shù)后分作三個(gè)部分：(1)取2×106個(gè)TIL細(xì)胞用抗體孵育后,上流式細(xì)胞儀檢測CD4+CD25+CD127lowTreg、CD8+T細(xì)胞占總TIL細(xì)胞的比率；(2)TIL細(xì)胞放在加有完全培養(yǎng)基的細(xì)胞培養(yǎng)管中,培養(yǎng)16h后,收集上清液,用ELISA試劑盒測定IL-2、IFN-γ、TNF-α的濃度；(3)TIL作為效應(yīng)細(xì)胞與CFSE標(biāo)記后的小鼠肝癌H22、Hepa1-6靶細(xì)胞按5：1效靶比充分混合,培養(yǎng)4h后,加入PI,流式細(xì)胞術(shù)檢測CFSE+PI+細(xì)胞即死亡的靶細(xì)胞的百分率。研究結(jié)果1.NDV7793對小鼠肝癌皮下移植瘤的抑制1)小鼠肝癌皮下移植瘤建模成功率為97.5%(78/80)。2)分析NDV7793給藥時(shí)間不同小鼠生存期可得：NDV組的荷瘤小鼠的生存期隨著NDV7793給藥天數(shù)增加而發(fā)生改變,而PBS陰性對照組的荷瘤小鼠的生存期不會(huì)因此而發(fā)生改變；NDV7793給藥4d的荷瘤小鼠生存期最長。3)分析各組給藥后生存期可得：NDV給藥組生存期顯著長于IL-2陽性對照組以及PBS陰性對照組和FLU給藥對照組,P0.05,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。4)分析各組給藥后的抑瘤效果可得：NDV7793給藥組的荷瘤小鼠的腫瘤重量比PBS陰性對照組、IL-2陽性對照組、FLU給藥對照組低,P0.05,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；NDV7793給藥組對H22肝癌移植瘤的抑制率明顯高于PBS陰性對照組、IL-2陽性對照組、FLU給藥對照組,P0.05,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2.NDV7793對小鼠肝癌皮下移植瘤內(nèi)TIL免疫功能的影響1)分析NDV7793給藥時(shí)間不同的分離自荷瘤小鼠腫瘤TIL的CD4+CD25+CD127lowTreg、CD8+T細(xì)胞占總TIL比例可得：NDV給藥組CD4+CD25+CD127lowTreg占總TIL百分率較PBS陰性對照組低,P0.05,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；NDV7793給藥1d-4d,隨著NDV給藥天數(shù)的增加,CD4+CD25+CD127lowTreg占總TIL百分率反而下降,CD8+T占總TIL百分率隨著升高,但是NDV7793給藥4d-7d,隨著NDV給藥天數(shù)的增加,CD4+CD25+CD127lowTreg占總TIL百分率隨著增加,CD8+T占總TIL百分率則隨之下降,NDV7793給藥4d的小鼠瘤內(nèi)CD4+CD25+CD127lowTreg占總TIL百分率最低(2.07±0.36)%、CD8+T占總TIL百分率最高(20.04±1.44)%。2)分析各給藥組分離自荷瘤小鼠腫瘤的TIL數(shù)量及CD4+CD25+CD127lowTreg、CD8+T細(xì)胞占總TIL比例可得：NDV給藥組分離自荷瘤小鼠腫瘤的TIL數(shù)量高于PBS陰性對照組、IL-2陽性對照組以及FLU給藥對照組,P0.05,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；NDV給藥組TIL的CD4+CD25+CD127lowTreg與總TIL的比例低于PBS陰性對照組、IL-2陽性對照組以及FLU給藥對照組,P0.05,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；NDV給藥組TIL的CD8+T與總TIL的比例高于PBS陰性對照組、FLU給藥對照組,P0.05,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,但NDV7793給藥組TIL的CD8+T與總TIL的比例與IL-2陽性對照組相比,P0.05,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。3)分析各給藥組分離白荷瘤小鼠腫瘤的TIL細(xì)胞培養(yǎng)上清IL-2、IFN-γ、TNT-α濃度結(jié)果可得：NDV給藥組TIL細(xì)胞培養(yǎng)上清IL-2、IFN-γ、TNF-α的平均濃度高于PBS陰性對照組、IL-2陽性對照組,以及FLU給藥對照組,P0.05,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。4)分析各給藥組分離自小鼠肝癌皮下移植瘤的TIL對小鼠H22、Hepa1-6肝癌細(xì)胞株的殺傷率可得：NDV給藥組TIL對小鼠H22、Hepa1-6肝癌細(xì)胞株的殺傷率高于PBS陰性對照組、IL-2陽性對照組以及FLU給藥對照組,P0.05,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論1. NDV7793可以抑制小鼠肝癌移植瘤的生長,NDV7793可以使荷瘤小鼠的生存期延長,且NDV7793給藥時(shí)間不同,延長生存期各異。2.NDV7793給藥可以促進(jìn)分離自小鼠肝癌皮下移植瘤的TIL增殖,可以改變分離白小鼠肝癌皮下移植瘤內(nèi)TIL的CD4+ CD25+ CD127l0WTreg、CD8+T細(xì)胞占總TIL比例；NDV7793給藥后,CD4+ CD25+ CD127l0WTreg、CD8+T細(xì)胞占總TIL比例隨著給藥時(shí)間的不同而有所變化,同時(shí)NDV7793給藥還可上調(diào)分離自小鼠肝癌移植瘤瘤的TIL細(xì)胞的體外培養(yǎng)上清IL-2、IFN-γ、TNF-α的濃度水平；同時(shí)NDV7793給藥尚能顯著提高分離自小鼠肝癌移植瘤瘤內(nèi)TIL體外對小鼠H22、Hepa1-6肝癌細(xì)胞株的殺傷作用。
【關(guān)鍵詞】：新城疫病毒 腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞 肝癌 皮下移植瘤
【學(xué)位授予單位】：廣西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R735.7
【目錄】：

• 主要中英文縮寫4-6
• 中文摘要6-10
• 英文摘要10-14
• 前言14-17
• 第一部分 NDV對小鼠H22肝癌皮下移植瘤生長的抑制作用17-27
• 1. 材料和方法17-21
• 2. 結(jié)果21-25
• 3. 討論25-27
• 第二部分 NDV對小鼠肝癌皮下移植瘤內(nèi)TIL的影響27-46
• 1. 材料和方法27-34
• 2. 結(jié)果34-42
• 3. 討論42-46
• 結(jié)論46
• 參考文獻(xiàn)46-53
• 綜述53-66
• 參考文獻(xiàn)58-66
• 致謝66-67
• 公開發(fā)表的學(xué)術(shù)論文67
• 基金項(xiàng)目67

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本文編號(hào)：484641