發(fā)布時(shí)間：2017-06-25 19:10

  本文關(guān)鍵詞：鐵蛋白重鏈亞基納米載藥系統(tǒng)的構(gòu)建及其逆轉(zhuǎn)乳腺癌細(xì)胞多藥耐藥性的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：癌癥是目前危害人類(lèi)健康的最嚴(yán)重的一類(lèi)疾病。在發(fā)達(dá)國(guó)家癌癥的死亡率僅次于心血管疾病居第二位,在我國(guó),癌癥的死亡率也逐年快速增長(zhǎng)中。目前癌癥的主要療法是手術(shù)配合化療,然而化療藥物的毒性副作用和癌細(xì)胞的耐藥性是癌癥治療中的主要障礙。本研究的主要目的是,構(gòu)建具有靶向性、高度生物安全性的人表皮生長(zhǎng)因子-鐵蛋白重鏈亞基納米載藥系統(tǒng)(DOX/EGF-5Cys-FTH1),以癌細(xì)胞膜表面過(guò)表達(dá)的表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)為靶點(diǎn),考察了該給藥系統(tǒng)逆轉(zhuǎn)人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7/ADR的耐藥性,并對(duì)其中的機(jī)制進(jìn)行了詳細(xì)研究。在本研究中,首先構(gòu)建靶向性鐵蛋白納米載藥系統(tǒng)。鐵蛋白是一種廣泛存在于人、動(dòng)植物體內(nèi)的天然蛋白,因此具有較高的生物安全性；表皮生長(zhǎng)因子受體在多種腫瘤細(xì)胞中高表達(dá),它已被用來(lái)作為用于癌癥治療的靶向目標(biāo)。因此,我們用基因工程的方法將人表皮生長(zhǎng)因子EGF融合于鐵蛋白重鏈亞基FTH1,構(gòu)建EGF-FTH1納米粒子。然而,FTH1的內(nèi)部空間太小裝載阿霉素載藥量低。為了解決這個(gè)問(wèn)題,我們通過(guò)基因突變的方法使得載體巰基化以獲得更多的連接位點(diǎn)從而增加載藥量。結(jié)果發(fā)現(xiàn),72分子阿霉素分子中可以被加載到一個(gè)DOX/EGF-5Cys-FTH1納米粒子上,且在pH5.0的酸性環(huán)境中藥物被釋放。此外,所得到的DOX/EGF-5Cys-FTH1納米載藥系統(tǒng)具有體積小(約12微米)和粒徑分布窄的特征。細(xì)胞內(nèi)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明DOX/EGF-5Cys-FTH1納米粒子可以進(jìn)入細(xì)胞內(nèi),并且MTT數(shù)據(jù)說(shuō)明該納米載藥系統(tǒng)與游離阿霉素藥物相比對(duì)耐藥株癌細(xì)胞具有更強(qiáng)的殺傷力。同時(shí),我們還對(duì)其逆轉(zhuǎn)耐藥性的機(jī)制做了詳細(xì)的研究,整個(gè)過(guò)程表明結(jié)果如下：1)通過(guò)受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用DOX/EGF-5Cys-FTH1納米載藥系統(tǒng)能攜帶更多的DOX進(jìn)入細(xì)胞,2)內(nèi)化入細(xì)胞后在溶酶體中快速釋放藥物分子,3)使得更多的藥物進(jìn)入細(xì)胞核,改變細(xì)胞的周期,引起細(xì)胞死亡。以上研究結(jié)果表明鐵蛋白納米粒子作為一類(lèi)新型的納米載體系統(tǒng),在癌癥靶向方面有巨大發(fā)展前景。也為其在臨床的進(jìn)一步應(yīng)用提供了一定的理論基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：鐵蛋白重鏈亞基納米載藥系統(tǒng) 靶向 耐藥性
【學(xué)位授予單位】：華東理工大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：R73-36
【目錄】：

• 摘要5-6
• Abstract6-12
• 第1章 前言12-26
• 1.1 癌癥治療現(xiàn)狀12-13
• 1.2 納米技術(shù)在癌癥中的研究情況13-14
• 1.2.1 目前用于癌癥治療的納米粒子種類(lèi)13
• 1.2.2 靶向治療的研究13-14
• 1.2.2.1 被動(dòng)靶向13-14
• 1.2.2.2 主動(dòng)靶向14
• 1.3 相關(guān)靶向方式的研究14-18
• 1.3.1 新生血管性靶向14
• 1.3.2 不受控制的細(xì)胞增殖靶向14-16
• 1.3.2.1 人表皮受體15
• 1.3.2.2 轉(zhuǎn)鐵蛋白受體15
• 1.3.2.3 葉酸受體15-16
• 1.3.3 腫瘤細(xì)胞靶向16-18
• 1.3.3.1 靶向乳腺癌16-17
• 1.3.3.2 結(jié)腸直腸癌靶向17
• 1.3.3.3 肺癌靶向17-18
• 1.3.3.4 前列腺癌靶向18
• 1.4 多藥耐藥性的研究18-24
• 1.4.1 脂質(zhì)體19
• 1.4.2 聚合物膠束19-20
• 1.4.3 多肽和蛋白20-21
• 1.4.4 磁性納米粒子21-22
• 1.4.5 金納米粒子22-23
• 1.4.6 硅納米粒子23
• 1.4.7 碳納米管23
• 1.4.8 固體脂質(zhì)納米粒子23-24
• 1.5 本論文的研究意義24-26
• 第2章 鐵蛋白重鏈亞基納米載藥系統(tǒng)的構(gòu)建及其特性研究26-56
• 摘要26
• 2.1 前言26-27
• 2.2 實(shí)驗(yàn)材料27-29
• 2.2.1 菌株和質(zhì)粒27
• 2.2.2 藥品和試劑27-28
• 2.2.3 實(shí)驗(yàn)儀器28-29
• 2.3 實(shí)驗(yàn)方法29-45
• 2.3.1 pET-28a(+)/EGF-5Cys-FTH1質(zhì)粒的構(gòu)建29-32
• 2.3.1.1 引物設(shè)計(jì)和模板驗(yàn)證29-30
• 2.3.1.2 質(zhì)粒的構(gòu)建30-32
• 2.3.2 pET-28a(+)/EGF-5Cys-FTH1納米粒子的制備32-37
• 2.3.3 非靶向EGF-5Cys-FTH1-m質(zhì)粒的構(gòu)建37-39
• 2.3.3.1 pET-28a(+)/EGF-5Cys-FTH1-m引物設(shè)計(jì)37
• 2.3.3.2 pET-28a(+)/EGF-5Cys-FTH1-m質(zhì)粒的構(gòu)建37-39
• 2.3.4 pET-28a(+)/EGF-5Cys-FTH1-m納米粒子的制備39-41
• 2.3.4.1 EGF-5Cys-FTH1-m蛋白在E.coli BL21中的表達(dá)39-41
• 2.3.5 目標(biāo)蛋白的表征41
• 2.3.5.1 非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(NATIVE-PAGE)41
• 2.3.5.2 透射電子顯微鏡41
• 2.3.6 EGF-5cys-FTH1和EGF-5cys-FTH1-m蛋白的熒光標(biāo)定41-42
• 2.3.6.1 熒光標(biāo)定后純化及偶聯(lián)比測(cè)定42
• 2.3.7 納米粒子與細(xì)胞結(jié)合研究42-43
• 2.3.7.1 細(xì)胞培養(yǎng)42
• 2.3.7.2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)目標(biāo)粒子與細(xì)胞結(jié)合情況42-43
• 2.3.7.3 熒光顯微鏡觀(guān)察目標(biāo)粒子與細(xì)胞結(jié)合情況43
• 2.3.8 DOX/EGF-5Cys-FTH1納米給藥系統(tǒng)的構(gòu)建43-45
• 2.3.8.1 交聯(lián)劑與阿霉素的連接44
• 2.3.8.2 EMCH-DOX與EGF-5Cys-FTH1蛋白的連接44-45
• 2.3.9 DOX/EGF-5Cys-FTH1納米載藥系統(tǒng)中藥物的體外釋放特性的研究45
• 2.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果45-54
• 2.4.1 EGF-5Cys-FTH1和EGF-5Cys-FTH1-m質(zhì)粒的構(gòu)建45-47
• 2.4.1.1 反向PCR產(chǎn)物驗(yàn)證45-46
• 2.4.1.2 質(zhì)粒pET-28a(+)/EGF-5Cys-FTH1菌落PCR產(chǎn)物的驗(yàn)證46
• 2.4.1.3 酶切驗(yàn)證46-47
• 2.4.1.4 目標(biāo)質(zhì)粒的測(cè)序結(jié)果47
• 2.4.2 納米粒子的制備47-49
• 2.4.3 EGF-5Cys-FTH1納米粒子的表征49-50
• 2.4.3.1 非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳49
• 2.4.3.2 透射電子顯微鏡(TEM)49-50
• 2.4.4 納米粒子在細(xì)胞水平上的靶向研究50-51
• 2.4.4.1 流式細(xì)胞儀法檢測(cè)納米粒子與細(xì)胞的結(jié)合50-51
• 2.4.4.2 熒光顯微鏡觀(guān)察納米粒子與細(xì)胞結(jié)合情況51
• 2.4.5 DOX/EGF-5Cys-FTH1載藥系統(tǒng)的構(gòu)建與表征51-53
• 2.4.5.1 EMCH-DOX與EGF-5Cys-FTH1連接52
• 2.4.5.2 DOX/EGF-5Cys-FTH1納米粒子的穩(wěn)定性52-53
• 2.4.5.3 DOX/EGF-5Cys-FTH1納米粒子表征53
• 2.4.6 DOX/EGF-5Cys-FTH1納米載藥系統(tǒng)中藥物在PBS緩沖溶液中的釋放53-54
• 2.5 討論54-55
• 2.6 小結(jié)55-56
• 第3章 鐵蛋白重鏈亞基納米載藥系統(tǒng)逆轉(zhuǎn)乳腺癌細(xì)胞多藥耐藥性的研究56-73
• 摘要56
• 3.1 前言56-57
• 3.2 實(shí)驗(yàn)材料57-59
• 3.2.1 細(xì)胞株57
• 3.2.2 藥品和試劑57-58
• 3.2.3 實(shí)驗(yàn)儀器58-59
• 3.3 實(shí)驗(yàn)方法59-64
• 3.3.1 DOX/EGF-5Cys-FTH1納米載藥系統(tǒng)在細(xì)胞水平的內(nèi)化59-61
• 3.3.1.1 癌細(xì)胞的復(fù)蘇和培養(yǎng)59
• 3.3.1.2 DOX/EGF-5Cys-FTH1納米給藥系統(tǒng)的靶向?qū)嶒?yàn)59-60
• 3.3.1.3 DOX/EGF-5Cys-FTH1納米載藥系統(tǒng)細(xì)胞水平內(nèi)化60-61
• 3.3.1.4 DOX/EGF-5Cys-FTH1納米載藥系統(tǒng)細(xì)胞內(nèi)定位61
• 3.3.2 DOX/EGF-5Cys-FTH1納米載藥系統(tǒng)的藥效研究61-64
• 3.3.2.1 DOX/EGF-5Cys-FTH1納米載藥系統(tǒng)細(xì)胞內(nèi)化后細(xì)胞形態(tài)研究61
• 3.3.2.2 DOX/EGF-5Cys-FTH1納米載藥系統(tǒng)內(nèi)化后藥效情況61-62
• 3.3.2.3 MTT法細(xì)胞存活率研究62-63
• 3.3.2.4 細(xì)胞周期研究63-64
• 3.3.2.5 細(xì)胞凋亡研究64
• 3.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果64-71
• 3.4.1 DOX/EGF-5Cys-FTH1納米給藥系統(tǒng)的藥效特性研究64-66
• 3.4.2 DOX/EGF-5Cys-FTH1納米載藥系統(tǒng)逆轉(zhuǎn)MCF-7/ADR細(xì)胞耐藥性機(jī)制研究66-71
• 3.4.2.1 DOX/EGF-5Cys-FTH1納米載藥系統(tǒng)靶向及內(nèi)化研究66-67
• 3.4.2.2 DOX/EGF-5Cys-FTH1納米載藥系統(tǒng)逆轉(zhuǎn)MCF-7/ARD耐藥性的研究67-68
• 3.4.2.3 DOX/EGF-5Cys-FTH1納米載藥系統(tǒng)細(xì)胞內(nèi)釋放機(jī)制68-69
• 3.4.2.4 DOX/EGF-5Cys-FTH1納米載藥系統(tǒng)釋放DOX入核情況研究69-70
• 3.4.2.5 DOX/EGF-5Cys-FTH1納米載藥系統(tǒng)對(duì)細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡的影響研究70-71
• 3.5 討論71-72
• 3.6 小結(jié)72-73
• 參考文獻(xiàn)73-80
• 致謝80

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  本文關(guān)鍵詞：鐵蛋白重鏈亞基納米載藥系統(tǒng)的構(gòu)建及其逆轉(zhuǎn)乳腺癌細(xì)胞多藥耐藥性的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號(hào)：483241