本文關(guān)鍵詞：K562細(xì)胞規(guī)�；囵B(yǎng)及砸酸多糖誘導(dǎo)其凋亡的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：本實(shí)驗以K562人慢性髓源白血病細(xì)胞為研究對象,研究了生物反應(yīng)器規(guī)�；囵B(yǎng)K562細(xì)胞的基本條件,另外通過MTT法、HE染色、流式細(xì)胞術(shù)、免疫熒光法和RT-PCR等手段從細(xì)胞形態(tài)學(xué)的變化、細(xì)胞周期、線粒體膜電位的變化、相關(guān)周期蛋白、相關(guān)凋亡蛋白及其基因的表達(dá)等方面探討了硒酸軟骨多糖對K562細(xì)胞的誘導(dǎo)凋亡作用及其作用機(jī)理。首先,對生物反應(yīng)器規(guī)�；囵B(yǎng)K562細(xì)胞的基本條件,即初始密度、培養(yǎng)基pH值和攪拌速度進(jìn)行了研究,結(jié)果表明,K562細(xì)胞規(guī)�；囵B(yǎng)的最佳條件為：細(xì)胞初始密度2.5×105個/mL,培養(yǎng)基pH值7.4,攪拌速度70r/min,該條件下細(xì)胞達(dá)到的最大生長密度為1.57×106個/mL。其次,研究了硒酸軟骨多糖對K562細(xì)胞的增殖抑制及凋亡誘導(dǎo)作用。通過MTT法檢測發(fā)現(xiàn)硒酸軟骨多糖能顯著抑制K562細(xì)胞的增殖,100μg/mL的軟骨多糖作用K562細(xì)胞48h后,抑制率可達(dá)到80%,且這種抑制作用呈現(xiàn)出明顯的濃度依賴性和時間依賴性。通過細(xì)胞形態(tài)顯微鏡觀察、HE染色和Hoechst33342/PI雙染發(fā)現(xiàn)硒酸軟骨多糖能夠使K562細(xì)胞出現(xiàn)體積縮小、染色質(zhì)固縮等典型的凋亡特征。通過流式細(xì)胞術(shù)發(fā)現(xiàn)：(a)硒酸軟骨多糖能夠?qū)562細(xì)胞阻滯在S期,多糖處理48h后S期細(xì)胞數(shù)由40.75%增至62.93%；(b)羅丹明-123染色顯示強(qiáng)熒光部分的細(xì)胞數(shù)量降低了18%,細(xì)胞線粒體膜電位顯著下降。通過免疫熒光和ELISA法檢測發(fā)現(xiàn),硒酸軟骨多糖處理后,細(xì)胞周期相關(guān)的Cyclin A、CDK2蛋白和Bcl-2蛋白表達(dá)減少,p21蛋白和caspase-9蛋白表達(dá)增多；通過實(shí)時定量熒光PCR技術(shù)對上述蛋白的mRNA表達(dá)進(jìn)行了檢測,實(shí)驗結(jié)果與蛋白表達(dá)一致。以上結(jié)果說明硒酸軟骨多糖能夠顯著抑制K562細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)其凋亡。本實(shí)驗為利用細(xì)胞規(guī)模化培養(yǎng)生產(chǎn)疫苗、抗體等生物制品奠定了基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：K562細(xì)胞 規(guī)�；囵B(yǎng) 硒酸軟骨多糖 細(xì)胞凋亡
【學(xué)位授予單位】：天津科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R733.7
【目錄】：

• 摘要4-5
• ABSTRACT5-8
• 1 前言8-23
• 1.1 人慢性髓源白血病(CML)概述8-9
• 1.1.1 CML簡介8
• 1.1.2 CML治療現(xiàn)狀8-9
• 1.2 多糖的研究現(xiàn)狀9-12
• 1.2.1 多糖概述9
• 1.2.2 多糖的種類9-10
• 1.2.3 多糖的生物活性10-11
• 1.2.4 多糖在抗腫瘤方面的研究11-12
• 1.3 硒多糖12-14
• 1.3.1 硒12
• 1.3.2 硒多糖的來源12-13
• 1.3.3 硒多糖的作用13-14
• 1.4 細(xì)胞規(guī)模化培養(yǎng)的發(fā)展14-16
• 1.4.1 細(xì)胞規(guī)模化培養(yǎng)技術(shù)及應(yīng)用15
• 1.4.2 細(xì)胞規(guī)�；囵B(yǎng)的影響因素15-16
• 1.4.3 細(xì)胞規(guī)模化培養(yǎng)的發(fā)展16
• 1.5 細(xì)胞凋亡16-21
• 1.5.1 細(xì)胞凋亡的途徑16-19
• 1.5.2 細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白19-21
• 1.6 本課題研究的目的和意義21-23
• 2 材料與方法23-36
• 2.1 實(shí)驗材料23-25
• 2.1.1 實(shí)驗試劑及藥品23-24
• 2.1.2 實(shí)驗儀器及設(shè)備24-25
• 2.1.3 實(shí)驗細(xì)胞25
• 2.2 K562細(xì)胞規(guī)�；囵B(yǎng)條件的確定25-26
• 2.2.1 初始密度對細(xì)胞生長的影響25
• 2.2.2 培養(yǎng)基最佳pH的確定25-26
• 2.2.3 反應(yīng)器最佳轉(zhuǎn)速的確定26
• 2.3 硒酸軟骨多糖對K562細(xì)胞的增殖抑制和凋亡誘導(dǎo)作用26-36
• 2.3.1 MTT法檢測硒酸軟骨多糖對K562細(xì)胞的增殖抑制作用26-27
• 2.3.2 HE染色檢測硒酸軟骨多糖對K562細(xì)胞的影響27-28
• 2.3.3 Hoechst33342/PI雙染法檢測硒酸軟骨多糖對K562細(xì)胞的作用28-29
• 2.3.4 流式細(xì)胞儀檢測硒酸軟骨多糖對K562細(xì)胞周期的影響29-30
• 2.3.5 羅丹明-123檢測K562細(xì)胞線粒體膜電位30
• 2.3.6 免疫熒光30-31
• 2.3.7 ELISA法檢測細(xì)胞內(nèi)CDK2和Bcl-2的表達(dá)31-32
• 2.3.8 RT-PCR檢測細(xì)胞內(nèi)表達(dá)水平32-36
• 3 結(jié)果與討論36-51
• 3.1 K562細(xì)胞規(guī)模化培養(yǎng)條件的確定36-38
• 3.1.1 最佳初始密度的確定36
• 3.1.2 培養(yǎng)基最佳pH的確定36-37
• 3.1.3 反應(yīng)器最佳轉(zhuǎn)速的確定37-38
• 3.2 硒酸軟骨多糖對K562細(xì)胞的增殖抑制及凋亡誘導(dǎo)作用38-51
• 3.2.1 MTT法檢測硒酸軟骨多糖對K562細(xì)胞的增殖抑制作用38-39
• 3.2.2 硒酸軟骨多糖作用不同時間K562的形態(tài)觀察39
• 3.2.3 HE染色檢測硒酸軟骨多糖對K562細(xì)胞的影響39-40
• 3.2.4 Hoechst 33342/PI雙染法檢測硒酸軟骨多糖對K562細(xì)胞的作用40-42
• 3.2.5 流式細(xì)胞儀檢測硒酸軟骨多糖對K562細(xì)胞周期的影響42-43
• 3.2.6 羅丹明-123檢測K562細(xì)胞線粒體膜電位43-44
• 3.2.7 免疫熒光44-46
• 3.2.8 ELISA法檢測細(xì)胞內(nèi)CDK2和Bcl-2的表達(dá)46-47
• 3.2.9 實(shí)時定量熒光PCR(RT-PCR)檢測相關(guān)蛋白mRNA的表達(dá)47-51
• 4 結(jié)論51-53
• 5 展望53-54
• 6 參考文獻(xiàn)54-63
• 7 攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表論文情況63-64
• 8 致謝64

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本文編號：482946