本文關(guān)鍵詞：人淚腺腺樣囊性癌腫瘤干細胞分離培養(yǎng)及腫瘤干細胞鑒定，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的1.培養(yǎng)來源于人的淚腺腺樣囊性癌腫瘤細胞系,為腫瘤干細胞樣細胞提取做準備。2.分離培養(yǎng)出來源于人的淚腺腺樣囊性癌腫瘤干細胞樣細胞。3.研究人淚腺腺樣囊性癌的腫瘤干細胞樣細胞并對其干細胞相關(guān)特性進行鑒定。方法1.實驗第一部分:腫瘤干細胞樣細胞的分離及其培養(yǎng)。常規(guī)含血清培養(yǎng)基培養(yǎng)人淚腺腺樣囊性癌腫瘤細胞系(Human Lacrimal Adenoid Cystic Carcinoma,LACC)細胞,根據(jù)其自身生長規(guī)律,選用生長狀態(tài)最佳的代數(shù),采用無血清懸浮培養(yǎng)法,即胰蛋白酶消化貼壁生長的細胞,制備成單細胞混懸液,以一定細胞密度接種于無血清培養(yǎng)基(serum free medium,SFM)中懸浮培養(yǎng)生長,定期更換培養(yǎng)基,從而收集獲得人淚腺腺樣囊性癌腫瘤干細胞樣細胞LACC-CSCs(Cancer Stem Cell,CSC),傳代或進行下一步鑒定。2.實驗第二部分:腫瘤干細胞樣細胞相關(guān)特性鑒定。收集采用無血清懸浮法培養(yǎng)獲得的生長穩(wěn)定的腫瘤干細胞微球體,應(yīng)用倒置相差顯微鏡觀察人淚腺腺樣囊性癌腫瘤細胞及腫瘤干細胞樣細胞形態(tài)學差異,流式細胞術(shù)分別檢測兩種類型細胞干細胞相關(guān)表面分子標志CD133,ABCG2的表達情況,應(yīng)用Transwell體外侵襲實驗檢測兩種類型細胞不同時間段細胞的侵襲能力差異,應(yīng)用胎牛血清誘導(dǎo)液及內(nèi)皮細胞誘導(dǎo)液誘導(dǎo)腫瘤干細胞樣細胞分化,檢測其定向分化潛能,體外裸鼠移植瘤實驗檢測兩種類型細胞致瘤力差別。結(jié)果1.LACC細胞接種在含血清培養(yǎng)基中培養(yǎng),細胞呈貼壁生長,形成鋪路石樣結(jié)構(gòu),接種在無血清培養(yǎng)基后,細胞逐漸漂浮并聚集成球生長,隨培養(yǎng)時間推移,細胞微球體逐漸增大,折光性較強,細胞間連接緊密,10~12天可形成形態(tài)規(guī)則的腫瘤微球體,略呈串珠狀或葡萄狀。通過連續(xù)傳代培養(yǎng),可保持良好的克隆成球能力。2.經(jīng)初步鑒定發(fā)現(xiàn)腫瘤細胞球體具有干細胞相關(guān)特征:1)倒置相差顯微鏡觀察普通腫瘤細胞在含胎牛血清培養(yǎng)基中呈現(xiàn)貼壁扁平生長的狀態(tài),類似鋪路石結(jié)構(gòu),應(yīng)用無血清懸浮培養(yǎng)液培養(yǎng)的腫瘤干細胞樣細胞呈葡萄球串珠狀生長,細胞微球體逐漸增大,形態(tài)上完全不同于普通腫瘤細胞。2)流式細胞儀檢測示LACC-CSCs表達CD133比率為(35.67±6.86)%,LACC為(0.46±0.48)%,二者比較差異具有統(tǒng)計學意義(t=-8.867,P0.05);LACC-CSCs表達ABCG2為(39.99±4.54)%,LACC為(6.75±1.34)%,二者比較差異具有統(tǒng)計學意義(t=-9.932,P0.05)。同普通LACC細胞相比,LACC腫瘤干細胞樣細胞表達干細胞相關(guān)表面分子標志,與LACC存在明顯差異。3)Transwell體外侵襲實驗示,培養(yǎng)24小時后,LACC-CSCs穿過Matrigel基底膜平均為(32.60±8.79)個/HP,LACC為(10.20±2.77)個/HP,兩組比較差異有統(tǒng)計學意義(t=5.433,P0.05);培養(yǎng)48小時后LACC-CSCs穿過Matrigel基底膜平均為(62.60±4.83)個/HP,LACC為(44±5.34)個/HP,兩組比較差異有統(tǒng)計學意義(t=5.779,P0.05)。LACC腫瘤干細胞樣細胞同普通LACC細胞相比具有更強的組織遷移侵襲能力,可能造成更嚴重的組織破壞。4)應(yīng)用血清誘導(dǎo)腫瘤干細胞球可見其逐漸貼壁生長,移形為貼壁的多邊形腫瘤細胞,同普通腫瘤細胞無異,成鋪路石樣形態(tài)。應(yīng)用含血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)和堿性成纖維生長因子(bFGF)等的血清培養(yǎng)基低氧誘導(dǎo),LACC-CSCs呈貼壁生長,細胞形態(tài)改變,連續(xù)誘導(dǎo)后三維基質(zhì)膠中可形成血管腔樣結(jié)構(gòu),表達血管內(nèi)皮標記CD31、CD34。說明LACC-CSCs在特定培養(yǎng)條件下具有定向分化能力。5)體外移植瘤實驗顯示,兩種細胞接種后均在觀察時間內(nèi)成瘤,成瘤率100%,相比于普通LACC細胞,腫瘤干細胞樣細胞成瘤時間短,成瘤體積大,具有更強的致瘤力。結(jié)論1.通過無血清懸浮培養(yǎng)法可獲得人淚腺腺樣囊性癌腫瘤干細胞樣細胞,通過改進培養(yǎng)條件和體系有望富集更多的腫瘤干細胞。2.富集到的腫瘤干細胞樣細胞表現(xiàn)出類似干細胞的特征,有較強的增殖能力,表達干細胞相關(guān)標志,較強的組織侵襲力、致瘤力,具有定向分化的潛能,為后續(xù)深入研究腫瘤干細胞及其靶向干細胞的治療方案提供實驗基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：淚腺腺樣囊性癌 腫瘤細胞 干細胞 無血清培養(yǎng)基 誘導(dǎo)分化 鑒定
【學位授予單位】：天津醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R739.7
【目錄】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-11
• 縮略語/符號說明11-12
• 前言12-17
• 研究現(xiàn)狀、成果12-15
• 研究目的、方法15-17
• 一、人淚腺腺樣囊性癌腫瘤干細胞樣細胞的分離培養(yǎng)17-24
• 1.1 對象和方法17-20
• 1.1.1 腫瘤細胞系17
• 1.1.2 實驗儀器17
• 1.1.3 主要試劑、耗材17-19
• 1.1.4 人淚腺腺樣囊性癌腫瘤干細胞樣細胞分離培養(yǎng)19-20
• 1.2 結(jié)果20-21
• 1.2.1 LACC細胞形態(tài)學20
• 1.2.2 LACC腫瘤干細胞樣細胞形態(tài)學表現(xiàn)20-21
• 1.3 討論21-23
• 1.3.1 腫瘤細胞系細胞的培養(yǎng)21-22
• 1.3.2 腫瘤干細胞樣細胞分離培養(yǎng)22-23
• 1.4 小結(jié)23-24
• 二、人淚腺腺樣囊性癌腫瘤干細胞樣細胞特性研研究24-39
• 2.1 對象和方法24-29
• 2.1.1 細胞24
• 2.1.2 實驗動物24
• 2.1.3 實驗儀器24
• 2.1.4 主要試劑、耗材24-25
• 2.1.5 試劑配制25-26
• 2.1.6 流式細胞術(shù)檢測干細胞相關(guān)表面分子標記的表達26
• 2.1.7 Transwell體外侵襲實驗26-27
• 2.1.8 腫瘤干細胞樣細胞定向誘導(dǎo)分化實驗27-28
• 2.1.9 體外裸鼠移植實驗28-29
• 2.2 結(jié)果29-33
• 2.2.1 干細胞相關(guān)表面分子CD133，ABCG2的表達情況29-30
• 2.2.2 Transwell體外侵襲力的差異30-31
• 2.2.3 LACC-CSCs可定向分化為血管內(nèi)皮樣細胞31-32
• 2.2.4 體外移植瘤實驗LACC-CSCs具有更強的致瘤力32-33
• 2.3 討論33-37
• 2.4 小結(jié)37-39
• 結(jié)論39-40
• 參考文獻40-44
• 發(fā)表論文和參加科研情況說明44-45
• 綜述 IGF-1R在眼科疾病中的研究進展45-57
• 綜述參考文獻51-57
• 致謝57

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  本文關(guān)鍵詞：人淚腺腺樣囊性癌腫瘤干細胞分離培養(yǎng)及腫瘤干細胞鑒定，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：473869