本文關(guān)鍵詞：人淚腺腺樣囊性癌腫瘤干細(xì)胞分離培養(yǎng)及腫瘤干細(xì)胞鑒定，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的1.培養(yǎng)來(lái)源于人的淚腺腺樣囊性癌腫瘤細(xì)胞系,為腫瘤干細(xì)胞樣細(xì)胞提取做準(zhǔn)備。2.分離培養(yǎng)出來(lái)源于人的淚腺腺樣囊性癌腫瘤干細(xì)胞樣細(xì)胞。3.研究人淚腺腺樣囊性癌的腫瘤干細(xì)胞樣細(xì)胞并對(duì)其干細(xì)胞相關(guān)特性進(jìn)行鑒定。方法1.實(shí)驗(yàn)第一部分:腫瘤干細(xì)胞樣細(xì)胞的分離及其培養(yǎng)。常規(guī)含血清培養(yǎng)基培養(yǎng)人淚腺腺樣囊性癌腫瘤細(xì)胞系(Human Lacrimal Adenoid Cystic Carcinoma,LACC)細(xì)胞,根據(jù)其自身生長(zhǎng)規(guī)律,選用生長(zhǎng)狀態(tài)最佳的代數(shù),采用無(wú)血清懸浮培養(yǎng)法,即胰蛋白酶消化貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞,制備成單細(xì)胞混懸液,以一定細(xì)胞密度接種于無(wú)血清培養(yǎng)基(serum free medium,SFM)中懸浮培養(yǎng)生長(zhǎng),定期更換培養(yǎng)基,從而收集獲得人淚腺腺樣囊性癌腫瘤干細(xì)胞樣細(xì)胞LACC-CSCs(Cancer Stem Cell,CSC),傳代或進(jìn)行下一步鑒定。2.實(shí)驗(yàn)第二部分:腫瘤干細(xì)胞樣細(xì)胞相關(guān)特性鑒定。收集采用無(wú)血清懸浮法培養(yǎng)獲得的生長(zhǎng)穩(wěn)定的腫瘤干細(xì)胞微球體,應(yīng)用倒置相差顯微鏡觀察人淚腺腺樣囊性癌腫瘤細(xì)胞及腫瘤干細(xì)胞樣細(xì)胞形態(tài)學(xué)差異,流式細(xì)胞術(shù)分別檢測(cè)兩種類(lèi)型細(xì)胞干細(xì)胞相關(guān)表面分子標(biāo)志CD133,ABCG2的表達(dá)情況,應(yīng)用Transwell體外侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)兩種類(lèi)型細(xì)胞不同時(shí)間段細(xì)胞的侵襲能力差異,應(yīng)用胎牛血清誘導(dǎo)液及內(nèi)皮細(xì)胞誘導(dǎo)液誘導(dǎo)腫瘤干細(xì)胞樣細(xì)胞分化,檢測(cè)其定向分化潛能,體外裸鼠移植瘤實(shí)驗(yàn)檢測(cè)兩種類(lèi)型細(xì)胞致瘤力差別。結(jié)果1.LACC細(xì)胞接種在含血清培養(yǎng)基中培養(yǎng),細(xì)胞呈貼壁生長(zhǎng),形成鋪路石樣結(jié)構(gòu),接種在無(wú)血清培養(yǎng)基后,細(xì)胞逐漸漂浮并聚集成球生長(zhǎng),隨培養(yǎng)時(shí)間推移,細(xì)胞微球體逐漸增大,折光性較強(qiáng),細(xì)胞間連接緊密,10~12天可形成形態(tài)規(guī)則的腫瘤微球體,略呈串珠狀或葡萄狀。通過(guò)連續(xù)傳代培養(yǎng),可保持良好的克隆成球能力。2.經(jīng)初步鑒定發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞球體具有干細(xì)胞相關(guān)特征:1)倒置相差顯微鏡觀察普通腫瘤細(xì)胞在含胎牛血清培養(yǎng)基中呈現(xiàn)貼壁扁平生長(zhǎng)的狀態(tài),類(lèi)似鋪路石結(jié)構(gòu),應(yīng)用無(wú)血清懸浮培養(yǎng)液培養(yǎng)的腫瘤干細(xì)胞樣細(xì)胞呈葡萄球串珠狀生長(zhǎng),細(xì)胞微球體逐漸增大,形態(tài)上完全不同于普通腫瘤細(xì)胞。2)流式細(xì)胞儀檢測(cè)示LACC-CSCs表達(dá)CD133比率為(35.67±6.86)%,LACC為(0.46±0.48)%,二者比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-8.867,P0.05);LACC-CSCs表達(dá)ABCG2為(39.99±4.54)%,LACC為(6.75±1.34)%,二者比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-9.932,P0.05)。同普通LACC細(xì)胞相比,LACC腫瘤干細(xì)胞樣細(xì)胞表達(dá)干細(xì)胞相關(guān)表面分子標(biāo)志,與LACC存在明顯差異。3)Transwell體外侵襲實(shí)驗(yàn)示,培養(yǎng)24小時(shí)后,LACC-CSCs穿過(guò)Matrigel基底膜平均為(32.60±8.79)個(gè)/HP,LACC為(10.20±2.77)個(gè)/HP,兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=5.433,P0.05);培養(yǎng)48小時(shí)后LACC-CSCs穿過(guò)Matrigel基底膜平均為(62.60±4.83)個(gè)/HP,LACC為(44±5.34)個(gè)/HP,兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=5.779,P0.05)。LACC腫瘤干細(xì)胞樣細(xì)胞同普通LACC細(xì)胞相比具有更強(qiáng)的組織遷移侵襲能力,可能造成更嚴(yán)重的組織破壞。4)應(yīng)用血清誘導(dǎo)腫瘤干細(xì)胞球可見(jiàn)其逐漸貼壁生長(zhǎng),移形為貼壁的多邊形腫瘤細(xì)胞,同普通腫瘤細(xì)胞無(wú)異,成鋪路石樣形態(tài)。應(yīng)用含血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)和堿性成纖維生長(zhǎng)因子(bFGF)等的血清培養(yǎng)基低氧誘導(dǎo),LACC-CSCs呈貼壁生長(zhǎng),細(xì)胞形態(tài)改變,連續(xù)誘導(dǎo)后三維基質(zhì)膠中可形成血管腔樣結(jié)構(gòu),表達(dá)血管內(nèi)皮標(biāo)記CD31、CD34。說(shuō)明LACC-CSCs在特定培養(yǎng)條件下具有定向分化能力。5)體外移植瘤實(shí)驗(yàn)顯示,兩種細(xì)胞接種后均在觀察時(shí)間內(nèi)成瘤,成瘤率100%,相比于普通LACC細(xì)胞,腫瘤干細(xì)胞樣細(xì)胞成瘤時(shí)間短,成瘤體積大,具有更強(qiáng)的致瘤力。結(jié)論1.通過(guò)無(wú)血清懸浮培養(yǎng)法可獲得人淚腺腺樣囊性癌腫瘤干細(xì)胞樣細(xì)胞,通過(guò)改進(jìn)培養(yǎng)條件和體系有望富集更多的腫瘤干細(xì)胞。2.富集到的腫瘤干細(xì)胞樣細(xì)胞表現(xiàn)出類(lèi)似干細(xì)胞的特征,有較強(qiáng)的增殖能力,表達(dá)干細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志,較強(qiáng)的組織侵襲力、致瘤力,具有定向分化的潛能,為后續(xù)深入研究腫瘤干細(xì)胞及其靶向干細(xì)胞的治療方案提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：淚腺腺樣囊性癌 腫瘤細(xì)胞 干細(xì)胞 無(wú)血清培養(yǎng)基 誘導(dǎo)分化 鑒定
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：R739.7
【目錄】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-11
• 縮略語(yǔ)/符號(hào)說(shuō)明11-12
• 前言12-17
• 研究現(xiàn)狀、成果12-15
• 研究目的、方法15-17
• 一、人淚腺腺樣囊性癌腫瘤干細(xì)胞樣細(xì)胞的分離培養(yǎng)17-24
• 1.1 對(duì)象和方法17-20
• 1.1.1 腫瘤細(xì)胞系17
• 1.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器17
• 1.1.3 主要試劑、耗材17-19
• 1.1.4 人淚腺腺樣囊性癌腫瘤干細(xì)胞樣細(xì)胞分離培養(yǎng)19-20
• 1.2 結(jié)果20-21
• 1.2.1 LACC細(xì)胞形態(tài)學(xué)20
• 1.2.2 LACC腫瘤干細(xì)胞樣細(xì)胞形態(tài)學(xué)表現(xiàn)20-21
• 1.3 討論21-23
• 1.3.1 腫瘤細(xì)胞系細(xì)胞的培養(yǎng)21-22
• 1.3.2 腫瘤干細(xì)胞樣細(xì)胞分離培養(yǎng)22-23
• 1.4 小結(jié)23-24
• 二、人淚腺腺樣囊性癌腫瘤干細(xì)胞樣細(xì)胞特性研研究24-39
• 2.1 對(duì)象和方法24-29
• 2.1.1 細(xì)胞24
• 2.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物24
• 2.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器24
• 2.1.4 主要試劑、耗材24-25
• 2.1.5 試劑配制25-26
• 2.1.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)干細(xì)胞相關(guān)表面分子標(biāo)記的表達(dá)26
• 2.1.7 Transwell體外侵襲實(shí)驗(yàn)26-27
• 2.1.8 腫瘤干細(xì)胞樣細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化實(shí)驗(yàn)27-28
• 2.1.9 體外裸鼠移植實(shí)驗(yàn)28-29
• 2.2 結(jié)果29-33
• 2.2.1 干細(xì)胞相關(guān)表面分子CD133，ABCG2的表達(dá)情況29-30
• 2.2.2 Transwell體外侵襲力的差異30-31
• 2.2.3 LACC-CSCs可定向分化為血管內(nèi)皮樣細(xì)胞31-32
• 2.2.4 體外移植瘤實(shí)驗(yàn)LACC-CSCs具有更強(qiáng)的致瘤力32-33
• 2.3 討論33-37
• 2.4 小結(jié)37-39
• 結(jié)論39-40
• 參考文獻(xiàn)40-44
• 發(fā)表論文和參加科研情況說(shuō)明44-45
• 綜述 IGF-1R在眼科疾病中的研究進(jìn)展45-57
• 綜述參考文獻(xiàn)51-57
• 致謝57

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  本文關(guān)鍵詞：人淚腺腺樣囊性癌腫瘤干細(xì)胞分離培養(yǎng)及腫瘤干細(xì)胞鑒定，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：473869