本文關鍵詞：源于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的鈣信號調(diào)節(jié)順鉑誘導的人宮頸癌HeLa細胞凋亡，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：背景： 順鉑是臨床上傳統(tǒng)的抗腫瘤藥物，也是婦科腫瘤最常用的化療藥物之一。然而，順鉑在治療期間的副作用及其治療抵抗限制了它在臨床的應用，因此明確順鉑的細胞殺傷機制尤為重要。傳統(tǒng)意義上認為，順鉑是通過損傷DNA和抑制DNA合成起到殺傷癌細胞的作用，這種作用引起了線粒體依賴的凋亡信號以及caspase相關的級聯(lián)反應，最終導致細胞死亡。在以往的關于疾病和腫瘤的研究認為，化療藥物可以引起細胞內(nèi)的鈣動員，通過靶向線粒體ROS代謝、ATP生成等過程，引發(fā)線粒體功能紊亂，導致細胞生長抑制和死亡。與此同時，越來越多的證據(jù)顯示，順鉑可以通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激觸發(fā)相關的凋亡信號，導致細胞死亡。然而，作為與鈣離子關系最為密切的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，鈣信號在化療藥物引起的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)來源的凋亡通路中的作用尚不清楚。 目的： 明確順鉑對人宮頸癌HeLa細胞內(nèi)鈣離子的影響，探究內(nèi)質(zhì)網(wǎng)來源的鈣信號在順鉑誘導的人宮頸癌HeLa細胞凋亡的作用，深入探討順鉑可能的細胞殺傷機制。 方法： 1、用不同濃度的順鉑（2.5μg/mL、5μg/mL和10μg/mL）處理HeLa細胞，分別作用0h、6h、12h和24h后，用熒光鈣離子指示劑Fluo-4/AM和Rhod-2/AM孵育細胞，應用激光共聚焦顯微鏡分別檢測細胞質(zhì)和線粒體內(nèi)鈣離子濃度的變化； 2、順鉑（5μg/mL）聯(lián)合應用鈣離子螯合劑BAPTA/AM（2.5μM）或IP3R抑制劑2-APB（100μM）處理HeLa細胞12h和24h小時后，用熒光鈣離子指示劑Fluo-4/AM和Rhod-2/AM孵育細胞，應用激光共聚焦顯微鏡分別檢測細胞質(zhì)和線粒體內(nèi)鈣離子濃度的變化； 3、順鉑單獨處理以及順鉑（5μg/mL）聯(lián)合應用鈣離子螯合劑BAPTA/AM （2.5μM）或IP3R抑制劑2-APB（100μM）處理HeLa細胞24h后，應用MTT試驗檢測細胞活性； 4、順鉑單獨處理以及順鉑（5μg/mL）聯(lián)合應用鈣離子螯合劑BAPTA/AM （2.5μM）或IP3R抑制劑2-APB（100μM）處理HeLa細胞24h后，應用流式細胞術檢測細胞凋亡； 5、順鉑單獨處理以及順鉑（5μg/mL）聯(lián)合應用鈣離子螯合劑BAPTA/AM （2.5μM）或IP3R抑制劑2-APB（100μM）處理HeLa細胞24h，應用熒光染料Hoechst33342著色細胞核，，在激光共聚焦熒光顯微鏡下觀察不同藥物處理組細胞核的變化； 6、順鉑單獨處理以及順鉑（5μg/mL）聯(lián)合應用鈣離子螯合劑BAPTA/AM （2.5μM）或IP3R抑制劑2-APB（100μM）處理HeLa細胞12h后，應用蛋白質(zhì)免疫印跡實驗檢測線粒體介導凋亡蛋白與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激相關蛋白在HeLa細胞中的表達； 7、順鉑單獨處理以及順鉑（5μg/mL）聯(lián)合應用鈣離子螯合劑BAPTA/AM （2.5μM）或IP3R抑制劑2-APB（100μM）處理HeLa細胞12h后，應用免疫熒光實驗檢測裂解的caspase-3、GRP78與CHOP在HeLa細胞中的表達。 結(jié)果： 1、順鉑同時增加了HeLa細胞細胞質(zhì)和線粒體內(nèi)的游離鈣離子濃度，且具有時間依賴性和劑量依賴性，聯(lián)合應用鈣離子螯合劑BAPTA/AM或IP3R抑制劑2-APB后，HeLa細胞細胞質(zhì)與線粒體內(nèi)的游離鈣離子濃度顯著降低； 2、順鉑抑制了HeLa細胞細胞活性并誘導了細胞凋亡，聯(lián)合應用應用鈣離子螯合劑BAPTA/AM或IP3R抑制劑2-APB減低了順鉑對HeLa細胞的毒性效應； 3、順鉑上調(diào)了鈣依賴性鈣調(diào)水解酶CAPN1與裂解的caspase-3的表達，聯(lián)合應用應用鈣離子螯合劑BAPTA/AM或IP3R抑制劑2-APB降低了順鉑誘導的CAPN1與裂解的caspase-3表達水平； 4、順鉑上調(diào)了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激蛋白GRP78、CHOP與裂解的caspase-4的表達，聯(lián)合應用應用鈣離子螯合劑BAPTA/AM或IP3R抑制劑2-APB降低了順鉑誘導的GRP78、CHOP與裂解的caspase-4表達水平； 結(jié)論： 順鉑誘導人宮頸癌HeLa細胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激，導致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)鈣平衡紊亂，大量鈣離子外流，外流的鈣信號參與調(diào)控了順鉑誘導的HeLa細胞線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)介導的細胞凋亡。
【關鍵詞】：鈣 順鉑 凋亡 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激 宮頸癌
【學位授予單位】：吉林大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R737.33
【目錄】：

• 前言4-5
• 中文摘要5-8
• abstract8-14
• 第1章 文獻綜述14-22
• 1.1 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激（ERS）14-16
• 1.2 UPR 跨膜信號轉(zhuǎn)導16-17
• 1.3 UPR 與凋亡間的信號轉(zhuǎn)導17-19
• 1.3.1 內(nèi)源性途徑18-19
• 1.3.2 外源性途徑19
• 1.4 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣調(diào)控與細胞死亡機制19-22
• 第2章 材料與方法22-29
• 2.1 實驗材料22-24
• 2.1.1 主要儀器22-23
• 2.1.2 主要試劑23-24
• 2.2 實驗方法24-28
• 2.2.1 人宮頸癌 Hela 細胞的培養(yǎng)24-25
• 2.2.1.1 細胞復蘇24
• 2.2.1.2 細胞傳代24
• 2.2.1.3 細胞凍存24-25
• 2.2.2 細胞活性檢測（MTT 比色法）25
• 2.2.3 Western blotting 蛋白免疫印跡實驗25-26
• 2.2.4 免疫熒光實驗26-27
• 2.2.4.1 細胞質(zhì)和線粒體內(nèi)游離鈣離子水平檢測26-27
• 2.2.4.2 觀測細胞核（凋亡）27
• 2.2.4.3 細胞內(nèi)蛋白水平（定性）檢測27
• 2.2.5 流式細胞術27-28
• 2.2.6 統(tǒng)計學處理28
• 2.3 實驗流程28-29
• 第3章 實驗結(jié)果29-41
• 3.1 順鉑對 HeLa 細胞內(nèi)鈣離子水平的影響29-31
• 3.1.1 順鉑引起 HeLa 細胞生長抑制29
• 3.1.2 順鉑增加細胞質(zhì)中游離的鈣離子水平29-30
• 3.1.3 順鉑增加線粒體中游離的鈣離子水平30-31
• 3.2 鈣信號參與調(diào)控順鉑誘導的 HeLa 細胞凋亡31-37
• 3.2.1 阻斷鈣信號后細胞質(zhì)內(nèi)鈣離子變化31-32
• 3.2.2 阻斷鈣信號后線粒體內(nèi)鈣離子變化32-33
• 3.2.3 阻斷鈣信號可以抑制順鉑引起的 HeLa 細胞凋亡33-37
• 3.3 順鉑誘導的促凋亡鈣信號來源于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激37-41
• 第4章 討論41-44
• 第5章 結(jié)論44-45
• 參考文獻45-58
• 作者簡介及在學期間所取得的科研成果58-59
• 致謝59-60

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