AKT與XRCC1相互促進堿基切除修復在化療藥物耐受中的作用
發(fā)布時間:2017-06-13 12:17
本文關鍵詞:AKT與XRCC1相互促進堿基切除修復在化療藥物耐受中的作用,由筆耕文化傳播整理發(fā)布。
【摘要】:目的腫瘤細胞多藥耐藥性(MDR)是制約癌癥治療效果的主要因素之一。MDR發(fā)生與多種因素有關,包括細胞膜上ABC家族成員蛋白的增多、谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶活性增強、拓撲異構(gòu)酶基因的突變,以及DNA修復能力的增強等。盡管各種新的化療藥物和治療方案不斷產(chǎn)生并應用,但在大多數(shù)最常見的惡性腫瘤中卻療效甚微,其主要原因是腫瘤細胞在接受化療藥物治療后不可避免的產(chǎn)生耐藥反應。因此,研究腫瘤細胞多藥耐受的形成機制對干預腫瘤的耐藥反應及增強化療藥物的療效具有重要意義。方法1為了研究腫瘤細胞耐藥反應的形成機制,我們首先建立了阿霉素耐受的A549細胞系(A549/DOX)和5-氟尿嘧啶耐受的HCT-8細胞系(HCT-8/5-FU),這兩種細胞株均表現(xiàn)出多藥耐受。通過免疫印跡實驗比較,比較藥物敏感細胞株和耐藥株中Akt信號通路的激活情況。2通過加入抑制劑的方法、免疫共沉淀實驗和激光共聚焦實驗,發(fā)現(xiàn)Akt和XRCC1之間的關系。3在藥物敏感的A549和HCT-8細胞中,細胞瞬時轉(zhuǎn)染XRCC1或其磷酸化突變體表達質(zhì)粒。4利用Akt抑制劑和BER抑制劑聯(lián)合化療藥物共處理耐藥的腫瘤細胞,流式細胞術(shù)檢測凋亡率。結(jié)論兩種耐藥細胞株中Akt信號通路均呈現(xiàn)異常激活,并且耐藥細胞中堿基切除修復(base excision repair, BER)能力更強,化療藥物誘導的DNA損傷明顯減少。因此,我們繼續(xù)分析了Akt信號通路與BER之間的關系。作為活躍的DNA損傷修復途徑,BER催化的底物范圍廣泛(如烷化劑、電離輻射以及鉑類藥物等形成的單功能DNA加合物等),因此BER修復功能增強與化療藥物耐藥反應關系密切。BER是由多種蛋白、經(jīng)多步驟完成的DNA修復反應。XRCC1是BER反應中不可或缺的核酸修復骨架蛋白。研究表明,XRCC1對Polβ、LIGⅢ及PARP有著穩(wěn)定和調(diào)控的作用。XRCC1可以發(fā)生磷酸化翻譯后修飾,且磷酸化水平與其蛋白水平有關。我們發(fā)現(xiàn),與敏感細胞相比,耐藥株中XRCC1蛋白水平及其磷酸化水平均明顯增高,如果抑制Akt信號通路,則XRCC1和p-XRCC1的表達明顯減少。為了進一步分析Akt和XRCC1的關系,我們通過免疫共沉淀實驗和激光共聚焦實驗發(fā)現(xiàn),Akt與XRCC1具有相互作用。此外,在對藥物敏感的A549和HCT-8細胞中過表達XRCC1或其磷酸化突變體能導致腫瘤細胞對化療藥物產(chǎn)生耐受。最后,我們利用Akt抑制劑和BER抑制劑聯(lián)合化療藥物共處理耐藥的腫瘤細胞,由化療藥物誘導的細胞凋亡明顯增加,說明Akt介導的BER在腫瘤細胞形成多藥耐受中具有重要作用。結(jié)論綜上所訴,本研究通過比較化療藥物敏感型和耐受型細胞中的差異,發(fā)現(xiàn)耐藥細胞中Akt異常激活與BER修復能力增強直接相關,該作用是通過Akt與XRCC1的相互作用實現(xiàn)的,即:Akt與XRCC1結(jié)合,促進其磷酸化,增加其蛋白水平,進而增強了BER修復能力,削弱了化療藥物對細胞的殺傷性。本研究揭示了腫瘤細胞形成多藥耐受的一種分子機制,該研究成果不僅為增強化療藥物療效提供理論基礎,也為臨床克服腫瘤耐藥提供參考。
【關鍵詞】:Akt XRCC1 堿基切除修復 腫瘤耐藥
【學位授予單位】:南京師范大學
【學位級別】:碩士
【學位授予年份】:2016
【分類號】:R730.53
【目錄】:
- 摘要3-5
- Abstract5-8
- 第1章 緒論8-18
- 1.1 多藥耐藥性(Multiple drug resistance,MDR)8-10
- 1.1.1 MDR8
- 1.1.2 MDR產(chǎn)生機制8-9
- 1.1.3 克服腫瘤多藥耐藥的策略9-10
- 1.2 堿基切除修復(BER)10-14
- 1.2.1 DNA損傷修復機制10-11
- 1.2.2 BER簡介及其過程11-12
- 1.2.3 BER的主要成員與MDR的關系12-14
- 1.3 Akt信號通路及其功能研究進展14-18
- 1.3.1 Akt信號通路14
- 1.3.2 Akt信號通路的功能14-16
- 1.3.3 Akt信號通路與多藥耐藥16-17
- 1.3.4 Akt信號在DNA修復中的作用17-18
- 第2章 Akt信號通路通過促進堿基切除修復調(diào)節(jié)細胞多藥耐藥性的分子機制研究18-43
- 2.1 實驗材料與方法19-22
- 2.1.1 抗體與試劑19-20
- 2.1.2 表達質(zhì)粒20
- 2.1.3 細胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染20
- 2.1.4 CCK-8測定細胞活力20
- 2.1.5 免疫印跡(Western blotting)與免疫共沉淀20-21
- 2.1.6 MMS敏感性實驗21
- 2.1.7 細胞凋亡檢測21-22
- 2.1.8 激光共聚焦實驗22
- 2.1.9 統(tǒng)計學處理22
- 2.2 實驗結(jié)果22-40
- 2.2.1 多藥耐藥細胞系的建立及其DNA損傷修復能力的檢測22-26
- 2.2.2 Akt信號通路促進了堿基切除修復26-29
- 2.2.3 Akt通過與XRCC1相互作用促進了BER29-33
- 2.2.4 過表達XRCC1及其磷酸化突變體削弱了化療藥物的細胞毒性33-37
- 2.2.5 MK2206和ABT-888聯(lián)用增加了化療藥物對耐藥細胞的殺傷性37-40
- 2.3 分析與討論40-43
- 附錄43-53
- 附錄A 實驗步驟43-46
- 附錄B 實驗用主要溶液、實驗儀器46-51
- 附錄C 實驗用主要溶液、實驗儀器51-53
- 參考文獻53-59
- 在讀期間發(fā)表的學術(shù)論文及研究成果59-60
- 致謝60
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本文編號:446506
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