本文關(guān)鍵詞：異牛肝菌素對(duì)人肺腺癌A549細(xì)胞的抑制作用及其機(jī)制研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的:近年來,隨著環(huán)境污染和人口老齡化等因素,全球癌癥患者和死亡病例不斷增加,并呈逐年迅猛增長(zhǎng)態(tài)勢(shì)。在所有的癌癥中,肺癌仍是最普遍和最致命的惡性腫瘤,每年全球肺癌新增病例約180萬(wàn),占全球所有癌癥新增病例的13%;每年約有160萬(wàn)人死于肺癌,占全球癌癥死亡病例的20%;肺癌患者的5年生存率不到15%。在中國(guó)肺癌的發(fā)病率和死亡率一直居于首位,約占全世界肺癌病例的1/3以上。目前,臨床上對(duì)癌癥的治療效果依然處在相對(duì)較低的水平,常用化療藥物的效能因其一系列的副反應(yīng)而受限,因此,尋找或合成更為安全有效的抗腫瘤藥物依然是擺在醫(yī)藥工作者面前的迫切任務(wù)。在很久以前真菌就有作為藥物的記載。有很多真菌類的代謝產(chǎn)物表現(xiàn)出明顯的抗腫瘤、抗氧化、抗感染和消炎止痛等作用。一些研究資料表明,天然植物和真菌類含有豐富的酚類化合物,其中部分化合物表現(xiàn)出了很高的生物活性。異牛肝菌素(iso-suillin)屬于異戊二烯基酚類化合物,從乳牛肝菌(Suillus flavus)中分離得到。通過篩選和研究發(fā)現(xiàn),iso-suillin表現(xiàn)出了較強(qiáng)的生物活性,能夠在體外有效抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng),誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯和凋亡;與順鉑(CDDP)和5-氟尿嘧啶(5-FU)比較,iso-suillin表現(xiàn)出了更強(qiáng)的抑瘤作用,并且對(duì)正常人的淋巴細(xì)胞沒有毒性。在以前研究的基礎(chǔ)上,本研究致力于通過對(duì)肺腺癌A549細(xì)胞的體外實(shí)驗(yàn)和裸鼠移植瘤實(shí)驗(yàn)來進(jìn)一步探討iso-suillin的抗腫瘤作用及機(jī)制。方法:1細(xì)胞培養(yǎng)A549細(xì)胞以RPMI 1640培養(yǎng)基,含10%FBS、青霉素100U/m L、鏈霉素100μg/m L,置于37℃、5%CO_2的飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。2 MTS法檢測(cè)不同濃度iso-suillin處理后A549細(xì)胞體外增殖活性并繪制細(xì)胞增殖抑制曲線。3流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期分布和凋亡率收集細(xì)胞后用預(yù)冷的PBS洗1次,離心棄上清,分別用1×Banding buffer重懸細(xì)胞,使其終濃度為1×106cells/m L,取100 u L,加入5μL Annexin V-FITC和10μL PI solution,室溫下避光染色15 min,Epics-XLII流式細(xì)胞儀檢測(cè),繪制直方圖并計(jì)算出G0/G1、S、G2/M期分布百分比及早期和晚期凋亡率。4.Iso-suillin對(duì)裸鼠的藥物毒性實(shí)驗(yàn)選取6只6~8周齡雌性裸鼠,皮下注射給藥,持續(xù)2周觀察裸鼠生活狀態(tài)及體重情況。5 Iso-suillin抑制裸鼠移植瘤增殖實(shí)驗(yàn)挑選腫瘤大小為90~110 mm3的裸鼠,隨機(jī)分成兩組,分別用生理鹽水和iso-suillin稀釋液瘤旁皮下注射給藥,隔天注射一次,觀察兩周,記錄小鼠體重和腫瘤大小。腫瘤體積按照以下公式來計(jì)算:腫瘤體積=長(zhǎng)徑×短徑2/2。6移植瘤組織包埋、切片及HE染色裸鼠腫瘤組織塊取出后放入10%中性甲醛中固定48 h以上,取出后將腫瘤組織切成約3 mm厚度,常規(guī)包埋和切片,HE染色,封片后鏡下觀察拍照。7移植瘤組織切片TUNEL法檢測(cè)凋亡組織切片脫蠟后參照TUNEL法操作步驟進(jìn)行染色后熒光顯微鏡下觀察拍照。8細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549細(xì)胞以1×105 cells/m L濃度接種于24孔板中,用不同濃度的iso-suillin處理24 h,PBS洗一遍后用倒置相差顯微鏡觀察拍照;然后將細(xì)胞用4%多聚甲醛固定15 min,用1%Triton X-100透膜5 min,加入DAPI(5μg/m L)染色,熒光顯微鏡下記錄其細(xì)胞核形態(tài)。9線粒體膜電位檢測(cè)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549細(xì)胞以不同濃度的iso-suillin處理后進(jìn)行JC-1染色,熒光顯微鏡下觀察拍照。10蛋白質(zhì)免疫印記(Western Blot)技術(shù)檢測(cè)相關(guān)蛋白的表達(dá)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549細(xì)胞經(jīng)不同濃度的iso-suillin處理后提取細(xì)胞總蛋白,經(jīng)蛋白定量后進(jìn)行Western Blot檢測(cè)DNA損傷,細(xì)胞周期和凋亡及p53信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)。11統(tǒng)計(jì)方法實(shí)驗(yàn)結(jié)果以(?)±s表示,用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件作單因素方差分析(One-Way ANOVA),取P0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。結(jié)果:1 Iso-suillin在體外對(duì)A549細(xì)胞增殖活性的影響A549細(xì)胞的增殖活性隨著iso-suillin濃度的增高和給藥時(shí)間的延長(zhǎng)而降低。不同濃度iso-suillin處理A549細(xì)胞6、12、24、48和72 h后,其半數(shù)抑制濃度IC50值分別為80.86、39.40、11.56、1.43和0.43μM。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,iso-suillin對(duì)體外培養(yǎng)的A549細(xì)胞具有明顯的抑制作用,且具有濃度和時(shí)間依賴性。2 Iso-suillin對(duì)裸鼠及A549細(xì)胞移植瘤生長(zhǎng)的影響經(jīng)過不同濃度iso-suillin皮下注射后未發(fā)現(xiàn)裸鼠的異常情況,裸鼠的飲食與體重增加情況與空白組比較沒有明顯差異。A549細(xì)胞裸鼠移植瘤成瘤率為100%,接種后第14 d,移植瘤體積生長(zhǎng)至約100 mm3。第1、5、9、13和17 d,對(duì)照組的裸鼠體重(g)分別為16.98±0.35、17.13±0.30、17.16±0.54、18.29±0.55和19.18±1.21;對(duì)照組移植瘤體積(mm3)分別為89.38±15.30、125.68±8.83、220.38±48.63、311.16±93.67和600.91±133.03;實(shí)驗(yàn)組裸鼠體重分別為17.12±0.36、17.13±0.38、17.58±0.61、18.46±1.15和19.62±0.83,實(shí)驗(yàn)組移植瘤體積分別為93.06±17.79、128.89±12.97、205.70±34.75、310.57±87.93和383.36±107.11。在第17 d,實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組比較,裸鼠體重之間無顯著性差異(P0.05),移植瘤體積之間具有顯著性差異(P0.05)。3 Iso-suillin對(duì)A549細(xì)胞周期分布及凋亡率的影響A549細(xì)胞經(jīng)0、3.12、6.25和12.5μM iso-suillin處理24 h后,G0/G1期細(xì)胞比例為44.8±2.17%、58.5±1.98%、59.3±1.76%、55.1±2.62%;S期細(xì)胞分別為46.9±2.23%、28.1±1.74%、27.8±3.02%、31.7±2.38%;G2/M期細(xì)胞分別為8.3±3.12%、13.4±2.56%、15.9±2.48%、13.2±1.56%。即隨著處理藥物濃度的增加G0/G1期細(xì)胞所占比例增加(P0.05)。A549細(xì)胞早期凋亡比例為3.16±0.0812%、9.71±1.25%、40.88±5.26%和39.35±4.56%,晚期凋亡比例為0.65±0.09%、3.07±1.32%、14.83±1.25%和18.43±2.35%,藥物處理組早期凋亡較對(duì)照組升高,具有明顯差異(P0.05);晚期凋亡較對(duì)照組升高明顯,具有濃度依賴性(P0.05)。4 Iso-suillin對(duì)A549細(xì)胞形態(tài)的影響不同濃度iso-suillin處理A549細(xì)胞24 h后,分別通過倒置相差顯微鏡在可見光下觀察和利用DAPI染色后在倒置熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞的變化及凋亡的形態(tài)特征。在可見光下觀察對(duì)照組細(xì)胞較多,貼壁牢固,個(gè)體狀態(tài)飽滿,細(xì)胞膜完整,呈梭形或多邊形,而實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞數(shù)目明顯減少,細(xì)胞開始脫離底壁,縮成圓形,細(xì)胞膜出泡,細(xì)胞裂解成很多凋亡小體分散開來;在熒光顯微鏡下觀察,對(duì)照組的細(xì)胞核界限清晰,呈圓形或者橢圓形,細(xì)胞核內(nèi)部藍(lán)色熒光均勻分布,偶可見分裂像的細(xì)胞核,而iso-suillin處理后的部分A549細(xì)胞,核開始縮小,染色質(zhì)分布不均勻,呈現(xiàn)凝集,核碎裂形成許多球形顆粒。5 Iso-suillin對(duì)移植瘤組織切片中細(xì)胞形態(tài)的影響裸鼠移植瘤經(jīng)過常規(guī)HE染色后,在顯微鏡下進(jìn)行觀察的結(jié)果:對(duì)照組的細(xì)胞形態(tài)完整,細(xì)胞核清晰可見,著色均勻,部分呈現(xiàn)分裂像,偶可見著色較深的染色體,細(xì)胞分裂旺盛;處理組移植瘤組織切片中的細(xì)胞胞漿濃縮,核固縮,著色較深,細(xì)胞膜不完整,可見腫瘤細(xì)胞壞死。組織切片經(jīng)過TUNEL染色后再由DAPI復(fù)染,放置在熒光顯微鏡下觀察,在相同的曝光時(shí)間下,對(duì)照組細(xì)胞核清晰可見,DNA均勻完整,TUNEL染色后代表DNA斷裂的綠色熒光亮度非常微弱,而實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞出現(xiàn)核固縮,DNA呈彌散狀態(tài),TUNEL染色后細(xì)胞內(nèi)的綠色熒光很強(qiáng),說明藥物處理后移植瘤內(nèi)細(xì)胞出現(xiàn)大面積的細(xì)胞DNA斷裂,表明iso-suillin能夠阻礙移植瘤內(nèi)細(xì)胞增殖,誘導(dǎo)裸鼠移植瘤細(xì)胞壞死或凋亡。6 Iso-suillin對(duì)A549細(xì)胞線粒體膜電位的影響iso-suillin處理A549細(xì)胞后,利用JC-1染色后在熒光顯微鏡下觀察,通過分析綠色和紅色熒光強(qiáng)度的比值來反應(yīng)線粒體膜電位變化,結(jié)果顯示,線粒體膜電位的降低與藥物濃度呈量效關(guān)系,線粒體膜電位隨藥物濃度升高而降低。7 Iso-suillin對(duì)A549細(xì)胞周期,凋亡及p53信號(hào)通路相關(guān)蛋白的影響A549細(xì)胞經(jīng)不同濃度iso-suillin處理后,Western Blot檢測(cè)相關(guān)蛋白的表達(dá)水平,結(jié)果如下:與β-actin蛋白比較,caspase-8蛋白的IOD比值分別為:0.17±0.04、0.21±0.04、0.30±0.05和0.45±0.07;caspase-9蛋白的IOD比值分別為0.14±0.03、0.37±0.05、0.41±0.07和0.64±0.06;pro-caspase-3蛋白的IOD比值分別為0.48±0.06、0.46±0.08、0.44±0.05和0.38±0.06;cleaved caspase-3蛋白的IOD比值分別為0.02±0.01、0.03±0.01、0.08±0.02和0.15±0.04;Bax蛋白的IOD比值分別為:0.43±0.05、0.57±0.03、1.56±0.04和2.83±0.14;Bcl-2蛋白的IOD比值分別為:0.16±0.03、0.14±0.04、0.09±0.02和0.07±0.02;p27蛋白的IOD比值分別為0.13±0.04、0.42±0.09、0.87±0.12和0.93±0.10;cyclin D1蛋白的IOD比值分別為1.42±0.11、0.87±0.09、0.43±0.04和0.08±0.03;CDK4蛋白的IOD比值分別為0.43±0.05、0.37±0.06、0.38±0.07和0.29±0.06;E2F-1蛋白的IOD比值分別為0.27±0.04、0.24±0.03、0.04±0.02和0.02±0.02;γ-H2AX蛋白的IOD比值分別為0.04±0.02、0.08±0.03、0.25±0.04和0.56±0.09;p53(phospho S20)蛋白的IOD比值分別為0.02±0.01、0.03±0.01、0.09±0.04和0.20±0.08;p53(phospho S15)蛋白的IOD比值分別為0.04±0.02、0.09±0.04、0.16±0.05和0.34±0.09;野生型p53蛋白的IOD比值分別為0.48±0.07、0.35±0.08、0.12±0.04和0.03±0.01。結(jié)果顯示:與對(duì)照組細(xì)胞相比,經(jīng)iso-suillin處理后的A549細(xì)胞中cleaved caspase-3、caspase-8、caspase-9、Bax、p27、γ-H2AX、p53(phospho S20)、p53(phospho S15)蛋白表達(dá)量增高,具有顯著性差異(P0.05);Bcl-2、E2F-1、p53、cyclin D1蛋白表達(dá)量降低,具有顯著性差異性(P0.05);pro-caspase 3和CDK4蛋白表達(dá)量略微下降,無顯著性差異(P0.05)。結(jié)論:1.Iso-suillin能夠在體外抑制A549細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。2.Iso-suillin能夠抑制A549細(xì)胞裸鼠移植瘤生長(zhǎng)并誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞壞死,而對(duì)裸鼠沒有明顯藥物毒性。3.Iso-suillin能夠誘導(dǎo)A549細(xì)胞發(fā)生G0/G1期阻滯。4.Iso-suillin能夠?qū)е翧549細(xì)胞產(chǎn)生DNA損傷。5.Iso-suillin可以通過p53信號(hào)通路誘導(dǎo)A549細(xì)胞周期阻滯和凋亡。
【關(guān)鍵詞】：異牛肝菌素 A549細(xì)胞 G0/G1期阻滯 凋亡 裸鼠移植瘤 p53 DNA損傷
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R734.2
【目錄】：

• 中文摘要4-9
• 英文摘要9-15
• 前言15-16
• 材料與方法16-26
• 結(jié)果26-29
• 附圖29-40
• 附表40-42
• 討論42-45
• 結(jié)論45-46
• 參考文獻(xiàn)46-49
• 綜述 異戊二烯基酚類化合物的研究進(jìn)展49-62
• 參考文獻(xiàn)57-62
• 致謝62-63
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷63

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本文編號(hào)：400108