目的:膀胱癌是發(fā)生在膀胱黏膜層的上皮性腫瘤。膀胱癌發(fā)病率較高,是我國(guó)最常見(jiàn)的泌尿系腫瘤。膀胱癌對(duì)傳統(tǒng)的放療化療并不敏感,且由于膀胱癌細(xì)胞生物表型上的多樣性,高病理分期的膀胱癌治療效果及預(yù)后均不理想。新型分子靶向藥物,通過(guò)激活抑癌基因或抑制癌基因的表達(dá),降低膀胱癌的復(fù)發(fā)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。近年來(lái),許多研究發(fā)現(xiàn)UNC5B是P53的直接靶基因,UNC5B可在缺少netrin-1結(jié)合或其自身過(guò)表達(dá)時(shí),介導(dǎo)細(xì)胞凋亡并抑制細(xì)胞增殖。同時(shí),UNC5B在多種腫瘤中具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖、遷移、侵襲的生物學(xué)效應(yīng),并可增強(qiáng)化療藥對(duì)腫瘤的敏感性。本研究通過(guò)慢病毒轉(zhuǎn)染、蛋白質(zhì)譜分析和免疫沉淀實(shí)驗(yàn)鑒定UNC5B結(jié)合的相關(guān)結(jié)合蛋白,通過(guò)生物信息學(xué)分析其激活的分子通路及重要靶點(diǎn),綜合利用流式細(xì)胞技術(shù)、基因敲減技術(shù)及體內(nèi)實(shí)驗(yàn),深入探索UNC5B調(diào)控膀胱癌細(xì)胞周期、抑制腫瘤增殖的分子機(jī)制。方法:1.確定UNC5B在膀胱癌組織及膀胱癌細(xì)胞中的內(nèi)源性表達(dá)。在中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院泌尿外科的病理標(biāo)本庫(kù)中,選取20對(duì)經(jīng)病理報(bào)告確認(rèn)的膀胱癌與癌旁組織。應(yīng)用PCR和WB法檢測(cè)UNC5B在膀胱癌標(biāo)本。用同樣方法檢測(cè)7種膀胱癌細(xì)胞器中UNC5...

【文章頁(yè)數(shù)】：87 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：博士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
英文略縮語(yǔ)
第一部分:UNC5B通過(guò)調(diào)控細(xì)胞周期抑制膀胱癌細(xì)胞的增殖
    1 前言
    2 材料與方法
        2.1 臨床資料及實(shí)驗(yàn)材料
            2.1.1 臨床資料來(lái)源
        2.2 實(shí)驗(yàn)試劑所需要主要儀器,藥品,試劑
            2.2.1 實(shí)驗(yàn)用膀胱癌細(xì)胞系
            2.2.2 實(shí)驗(yàn)儀器
            2.2.3 實(shí)驗(yàn)試劑
        2.3 試驗(yàn)方法
            2.3.1 免疫印跡（Western Blot）
            2.3.2 實(shí)時(shí)定量PCR
            2.3.3 細(xì)胞培養(yǎng)
            2.3.4 流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞周期
            2.3.5 免疫熒光
            2.3.6 流式細(xì)胞儀測(cè)活細(xì)胞免疫熒光
            2.3.7 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染膀胱癌細(xì)胞
            2.3.8 慢病毒轉(zhuǎn)染膀胱癌細(xì)胞
            2.3.9 諾考達(dá)唑同步化膀胱癌細(xì)胞周期及細(xì)胞周期檢測(cè)
            2.3.10 RCTA法檢測(cè)細(xì)胞增殖曲線(xiàn)
            2.3.11 UNC5B質(zhì)粒胞內(nèi)段的克隆構(gòu)建
            2.3.12 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
    3 結(jié)果
        3.1 PCR顯示UNC5B在膀胱癌中是抑癌因子
        3.2 PCR確定UNC5B在各細(xì)胞中的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染
        3.3 Western Blot確定UNC5B的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染
        3.4 熒光鏡確定UNC5B在細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染
        3.5 流式細(xì)胞熒光技術(shù)確定UNC5B的轉(zhuǎn)染
        3.6 UNC5B胞內(nèi)段真核表達(dá)體的構(gòu)建
        3.7 RCTA顯示全長(zhǎng)UNC5B抑制膀胱癌細(xì)胞增殖
        3.8 GO分析顯示UNC5B抑制細(xì)胞增殖與周期調(diào)控相關(guān)
        3.9 全長(zhǎng)UNC5B介導(dǎo)了膀胱癌細(xì)胞的G2/M周期阻滯
    4 討論
    5 結(jié)論
第二部分: UNC5B通過(guò)結(jié)合CDC14A與 P53 磷酸化P53 介導(dǎo)G2/M周期阻滯
    1 前言
    2 材料與方法
        2.1 實(shí)驗(yàn)試劑所需要主要儀器,藥品,試劑
            2.1.1 實(shí)驗(yàn)用膀胱癌細(xì)胞系
            2.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器
            2.1.3 實(shí)驗(yàn)試劑
        2.2 試驗(yàn)方法
            2.2.1 免疫印跡(Western Blot)
            2.2.2 實(shí)時(shí)定量PCR
            2.2.3 免疫共沉淀(CO-IP)試驗(yàn)
            2.2.4 快速銀染法鑒定差異蛋白
            2.2.5 蛋白質(zhì)譜鑒定及生信分析
            2.2.6 異種移植瘤模型
            2.2.7 免疫組化
            2.2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
    3 結(jié)果
        3.1 快速銀染法檢測(cè)組間的差異蛋白
        3.2 PPI分析顯示了UNC5B介導(dǎo)周期阻滯的蛋白互作模式
        3.3 KEGG分析顯示CDC14A是介導(dǎo)周期阻滯的關(guān)鍵蛋白
        3.4 TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)顯示CDC14A與膀胱癌的相關(guān)性
        3.5 CO-IP證實(shí)CDC14A和 P53 可以結(jié)合UNC5B
        3.6 過(guò)表達(dá)UNC5B通過(guò)去磷酸化P53介導(dǎo)相關(guān)周期蛋白的改變
        3.7 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)UNC5B的體內(nèi)抑癌效應(yīng)
        3.8 免疫組化驗(yàn)證UNC5B的抑癌效應(yīng)
    4 討論
    5 結(jié)論
第三部分: 敲除CDC14A抑制UNC5B介導(dǎo)的周期阻滯并降低了UNC5B的體內(nèi)抑癌效應(yīng).
    1 前言
    2 材料與方法
        2.1 實(shí)驗(yàn)試劑所需要主要儀器,藥品,試劑
            2.1.1 實(shí)驗(yàn)用膀胱癌細(xì)胞系
            2.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器
            2.1.3 實(shí)驗(yàn)試劑
        2.2 試驗(yàn)方法
            2.2.1 免疫印跡(Western Blot)
            2.2.2 實(shí)時(shí)定量PCR
            2.2.3 細(xì)胞培養(yǎng)
            2.2.4 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染膀胱癌細(xì)胞
            2.2.5 慢病毒轉(zhuǎn)染膀胱癌細(xì)胞
            2.2.6 RCTA法檢測(cè)細(xì)胞增殖曲線(xiàn)
            2.2.7 流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞周期
            2.2.8 異種移植瘤模型
            2.2.9 免疫組化
            2.2.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
    3 結(jié)果
        3.1 CDC14A的成功敲減
        3.2 CDC14A的敲減抑制了UNC5B介導(dǎo)的G2/M周期阻滯效應(yīng)
        3.3 CDC14A的敲減與細(xì)胞周期蛋白的表達(dá)相關(guān)
        3.4 CDC14A敲減回復(fù)了UNC5B在5637 細(xì)胞中的周期抑制效應(yīng)
        3.5 CDC14A敲減回復(fù)了UNC5B在 T24 細(xì)胞中的周期抑制效應(yīng)
        3.6 CDC14A的敲減降低了UNC5B的體內(nèi)抑癌效應(yīng)
        3.7 CDC14A的敲減增加了Ki67 的表達(dá),降低了P53 的表達(dá)
        3.8 UNC5B通過(guò)CDC14A及 P53 介導(dǎo)周期阻滯的效應(yīng)圖
    4 討論
    5 結(jié)論
本論文創(chuàng)新性的自我評(píng)價(jià)
參考文獻(xiàn)
綜述
    參考文獻(xiàn)
攻讀學(xué)位期間取得的研究成果
致謝
個(gè)人簡(jiǎn)歷



本文編號(hào)：3870188