神經(jīng)母細胞瘤斷點家族(Neuroblastoma Breakpoint Family,NBPF)擁有24個成員,該家族成員與神經(jīng)母細胞瘤及其他癌癥的發(fā)生相關(guān),這是一個在人類進化譜系上新出現(xiàn)的基因,由N端及不同數(shù)量的Olduvai結(jié)構(gòu)域組成。Olduvai結(jié)構(gòu)域在人類譜系上經(jīng)歷了快速且大量地增長,在人類中擁有最高數(shù)量的302個拷貝,在小鼠中只有1個拷貝,而在非哺乳動物中不存在。研究發(fā)現(xiàn)Olduvai的拷貝數(shù)異常與大腦腦尺寸有關(guān),并與正常及病變的人腦灰質(zhì)體積及神經(jīng)元數(shù)目相關(guān),Olduvai拷貝數(shù)的增加與人類頭大綜合征及自閉癥相關(guān),而拷貝數(shù)的減少與頭小綜合征及精神分類癥有關(guān)。Olduvai結(jié)構(gòu)域在人體各個組織中都表達,尤其在大腦認知相關(guān)的區(qū)域中高表達,且顯示出神經(jīng)元特異性表達。除了生物信息學和統(tǒng)計學手段證明Olduvai結(jié)構(gòu)域在進化上和大腦認知型疾病相關(guān)以外,對Olduvai結(jié)構(gòu)域及N端的生化性質(zhì)一無所知。NBPF15含有長度超過100個氨基酸的N端和6個不同亞型的Olduvai結(jié)構(gòu)域。我們在體外合成了NBPF15核苷酸序列,通過酶切連接構(gòu)建在不同的表達載體中,并進行了 NBPF15全長及截...

【文章頁數(shù)】：129 頁

【學位級別】：博士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
第一章 文獻綜述
    1.1 NBPF15的研究歷史與進展
        1.1.1 Olduvai結(jié)構(gòu)域與NBPF基因
        1.1.2 Olduvai結(jié)構(gòu)域在人類基因組上的拷貝數(shù)分析及特點
        1.1.3 Olduvai結(jié)構(gòu)域與疾病
        1.1.4 Olduvai與其他基因的聯(lián)系
        1.1.5 NBPF基因
        1.1.6 神經(jīng)退行性疾病與相變
        1.1.7 相變與疾病、衰老及病理學研究
    1.2 DDX43的研究歷史與進展
        1.2.1 DEAD-box RNA解旋酶
        1.2.2 解旋酶DDX43
    1.3 本文的研究目的與意義
        1.3.1 NBPF15研究的目的與意義
        1.3.2 DDX43研究的目的與意義
第二章 NBPF15實驗設(shè)備、材料及方法
    2.1 實驗設(shè)備
    2.2 實驗試劑
        2.2.1 主要生化試劑
        2.2.2 溶液配制
    2.3 實驗方法
        2.3.1 全長及截短蛋白的構(gòu)建
        2.3.2 蛋白的小樣表達純化
        2.3.3 蛋白的大樣表達純化
        2.3.4 蛋白二三級結(jié)構(gòu)預測
        2.3.5 蛋白聚集狀態(tài)測定
        2.3.6 蛋白均一性測定
        2.3.7 小角衍射(SAXS)和圓二色譜(CD)實驗
        2.3.8 透射電子顯微鏡和微分差干涉顯微鏡觀察
        2.3.9 單蛋白的結(jié)晶篩選
第三章 NBPF15結(jié)果與分析
    3.1 NBPF15蛋白的體外表達和純化
        3.1.1 NBPF15全長及截短蛋白的表達
        3.1.2 NBPF15截短蛋白的純化
    3.2 NBPF15截短蛋白聚集性質(zhì)的分析
        3.2.1 第一類蛋白擁有多種聚集狀態(tài)
        3.2.2 第二類蛋白擁有兩種或者三種聚集狀態(tài)
        3.2.3 第三類蛋白擁有單一聚集狀態(tài)
    3.3 含有N端的NBPF15蛋白的基本生化性質(zhì)
        3.3.1 SEC-SAXS研究NBPF15蛋白
        3.3.2 CD研究NBPF15蛋白
        3.3.3 TEM觀察不同的NBPF15截短蛋白
        3.3.4 使用在線軟件預測NBPF15蛋白的有序性
    3.4 NBPF15N端蛋白的相變
    3.5 小結(jié)
第四章 DDX43實驗材料和方法
    4.1 DDX43表達載體的構(gòu)建
        4.1.1 pET-15b-Sumo-DDX43質(zhì)粒的構(gòu)建
        4.1.2 DDX43截短及中間引入3C酶切位點的質(zhì)粒構(gòu)建
    4.2 pET-15b-Sumo-DDX43的蛋白純化
    4.3 基于熒光各向異性值的蛋白與底物結(jié)合實驗
    4.4 DDX43及其截短蛋白解旋活力的測定
    4.5 DDX43的蛋白酶消化實驗
    4.6 DDX43及其截短蛋白結(jié)晶底物與條件的篩選
        4.6.1 單蛋白結(jié)晶點樣
        4.6.2 蛋白與底物復合結(jié)晶篩選
第五章 DDX43結(jié)果與分析
    5.1 DDX43蛋白的體外表達
    5.2 DDX43全長蛋白與底物親和力的測定
    5.3 DDX43截短蛋白與底物親和力的測定
        5.3.1 酶標儀檢測DDX43截短蛋白與底物的親和力
        5.3.2 DDX43結(jié)合底物的主要結(jié)構(gòu)域
    5.4 DDX43的解旋活性
    5.5 DDX43蛋白酶消化實驗
    5.6 DDX43的結(jié)晶篩選
    5.7 小結(jié)
第六章 討論與展望
    6.1 NBPF15實驗的討論與展望
    6.2 DDX43實驗的討論與展望
參考文獻
主要符號對照表
附錄
致謝
個人簡歷



本文編號：3844881