目的優(yōu)化嵌合抗原受體T(CAR-T)細(xì)胞的體外培養(yǎng)體系及慢病毒侵染條件。方法 CD3磁珠分離純化健康人外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)及健康孕婦臍帶血單個(gè)核細(xì)胞(UCBMC),于8種不同培養(yǎng)體系進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng),培養(yǎng)體系包括以下成分的不同組合:重組人白細(xì)胞介素2(rhIL-2)、rhIL-12、rhIL-18、rhIL-7、 rhIL-21、 TWS119。分別于第0、 3、 5、 7、 10、 18天進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)檢測(cè)細(xì)胞增殖情況,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞程序性死亡蛋白1(PD-1)的表達(dá), ELISA檢測(cè)γ干擾素(IFN-γ)釋放,優(yōu)化T細(xì)胞體外培養(yǎng)體系。采用(0、 20、 50)μg/mL重組人纖連蛋白(RetroNectin^?),(250、 500、 1000)ng/mL抗人CD3/CD28抗體包被培養(yǎng)板,以感染復(fù)數(shù)(MOI)=3、 5的陰性對(duì)照慢病毒侵染T細(xì)胞72 h,于熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白(GFP)表達(dá)情況,初步判斷病毒侵染效率;流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD3/GFP陽(yáng)性率,以獲得慢病毒侵染條件。包裝CD19 CAR慢病毒,實(shí)時(shí)熒光定量PCR、 Western blot...

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【文章目錄】：
1 材料和方法
    1.1 材料
    1.2 方法
        1.2.1 磁珠分離外周血及臍帶血T細(xì)胞
        1.2.2 分離細(xì)胞的擴(kuò)增培養(yǎng)
        1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)單個(gè)核細(xì)胞PD-1表達(dá)
        1.2.4 ELISA檢測(cè)培養(yǎng)的單個(gè)核細(xì)胞上清液IFN-γ水平
        1.2.5 慢病毒侵染
        1.2.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)病毒侵染T細(xì)胞效率
        1.2.7 構(gòu)建并制備CD19CAR慢病毒
        1.2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
2 結(jié)果
    2.1 磁珠分離外周血及臍帶血T細(xì)胞
    2.2外周血及臍帶血T細(xì)胞體外培養(yǎng)體系的優(yōu)化
    2.3 病毒侵染條件優(yōu)化
    2.4 CAR-T細(xì)胞的制備及培養(yǎng)
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