目的:2018年全球約有100萬新的胃癌病例和約70萬死亡病例,其中約一半發(fā)生在中國。臨床上根治性切除術(shù)受限于胃癌分期、胃癌發(fā)生的部位等,且無普遍適用的藥物。迫切需要對胃癌的發(fā)生發(fā)展尤其是惡性增殖的過程進行深入研究。FOXP3轉(zhuǎn)錄因子被報道參與多種腫瘤的增殖和遷移等過程。FOXP3的功能與其在細胞內(nèi)的定位和磷酸化(p-FOXP3)密切相關(guān)。我們及其他的研究發(fā)現(xiàn)FOXP3與胃癌的進展密切相關(guān)。FOXP3如何影響胃癌的增殖?FOXP3的表達調(diào)控模式是怎樣的?細胞質(zhì)中的FOXP3蛋白如何轉(zhuǎn)位進入細胞核參與下游基因表達的調(diào)控?對這些問題進行深入研究可以加深對胃癌發(fā)生發(fā)展的理解,為胃癌的臨床診斷和治療提供可能的檢測指標和藥物靶點,并為此提供理論依據(jù)。材料和方法:利用PCR、定點突變技術(shù)和同源重組介導的連接構(gòu)建各個基因的過表達或敲低質(zhì)粒以及野生型和定點突變型的熒光素酶報告基因質(zhì)粒。利用短發(fā)夾RNA(shRNA)結(jié)合慢病毒篩選穩(wěn)定敲低內(nèi)源性基因表達的胃癌細胞系。利用實時熒光定量PCR(qRT-PCR)和蛋白質(zhì)印跡(WB)檢測各種基因的表達情況。利用CCK-8細胞活力測定和EdU細胞增殖測定檢測胃癌細...

【文章頁數(shù)】：111 頁

【學位級別】：博士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
第1章 引言
    1.1 胃癌的臨床現(xiàn)狀
        1.1.1 胃癌的流行病學
        1.1.2 胃癌的分類
        1.1.3 胃癌的致病因素
        1.1.4 胃癌的臨床診斷和治療
    1.2 胃癌與惡性增殖
    1.3 本課題的目的和意義
第2章 FOXP3調(diào)控胃癌增殖及其機制研究
    2.1 前言
        2.1.1 FOXP3的基因信息
        2.1.2 FOXP3與免疫
        2.1.3 FOXP3與腫瘤
        2.1.4 FOXP3調(diào)控的基因
    2.2 材料
        2.2.1 菌種
        2.2.2 質(zhì)粒載體
        2.2.3 細胞系
        2.2.4 裸鼠
        2.2.5 試劑
        2.2.6 耗材
        2.2.7 儀器與設(shè)備
    2.3 實驗方法
        2.3.1 質(zhì)粒構(gòu)建
        2.3.2 質(zhì)粒提取
        2.3.3 細胞培養(yǎng)
        2.3.4 細胞轉(zhuǎn)染
        2.3.5 慢病毒包裝及滴度測定
        2.3.6 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞篩選
        2.3.7 RNA提取和反轉(zhuǎn)錄(RT)
        2.3.8 實時熒光定量PCR(q RT-PCR)
        2.3.9 蛋白質(zhì)提取和二辛可寧酸(BCA)法濃度測定
        2.3.10 蛋白質(zhì)印跡法(WB)
        2.3.11 Cell Counting Kit-8(CCK-8)細胞活力測定
        2.3.12 5-乙炔基-2’脫氧尿嘧啶核苷(EdU)細胞增殖測定
        2.3.13 熒光素酶報告基因活性分析(luciferase assay)
        2.3.14 染色質(zhì)免疫共沉淀(ChIP)
        2.3.15 裸鼠皮下成瘤
        2.3.16 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析
    2.4 結(jié)果
        2.4.1 FOXP3表達水平與胃癌的發(fā)生相關(guān)
        2.4.2 穩(wěn)定敲低FOXP3在細胞水平促進胃癌增殖
        2.4.3 穩(wěn)定敲低FOXP3在體內(nèi)促進胃癌增殖
        2.4.4 穩(wěn)定敲低FOXP3直接促進增殖相關(guān)基因的表達
        2.4.5 FOXP3直接靶向增殖相關(guān)基因的啟動子抑制其轉(zhuǎn)錄活性
    2.5 討論
第3章 PRKAR2A-AS1/PKR2 軸通過調(diào)控FOXP3 表達影響胃癌增殖
    3.1 前言
        3.1.1 MiRNA與胃癌
        3.1.2 Lnc RNA與胃癌
    3.2 材料
        3.2.1 菌種
        3.2.2 質(zhì)粒載體
        3.2.3 細胞系
        3.2.4 裸鼠
        3.2.5 試劑
        3.2.6 耗材
        3.2.7 儀器與設(shè)備
    3.3 方法
        3.3.1 質(zhì)粒構(gòu)建
        3.3.2 質(zhì)粒提取
        3.3.3 細胞培養(yǎng)
        3.3.4 細胞轉(zhuǎn)染
        3.3.5 Lentivirus包裝及滴度測定
        3.3.6 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞篩選
        3.3.7 RNA提取和RT
        3.3.8 QRT-PCR
        3.3.9 蛋白質(zhì)提取和BCA法濃度測定
        3.3.10 WB
        3.3.11 CCK-8細胞活力測定
        3.3.12 EdU細胞增殖測定
        3.3.13 luciferase assay
        3.3.14 RNA結(jié)合蛋白免疫沉淀(RIP)
        3.3.15 裸鼠皮下成瘤
        3.3.16 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析
    3.4 結(jié)果
        3.4.1 miR-34a-5p表達水平與胃癌的發(fā)生相關(guān)
        3.4.2 穩(wěn)定敲低miR-34a-5p在細胞水平促進胃癌增殖
        3.4.3 穩(wěn)定敲低miR-34a-5p在體內(nèi)促進胃癌增殖
        3.4.4 mi R-34a-5p通過靶向FOXP3的3'UTR調(diào)控其表達
        3.4.5 PRKAR2A-AS1 表達水平與胃癌的發(fā)生相關(guān)
        3.4.6 穩(wěn)定敲低PRKAR2A-AS1 在細胞水平促進胃癌增殖
        3.4.7 穩(wěn)定敲低PRKAR2A-AS1 在體內(nèi)促進胃癌增殖
        3.4.8 PRKAR2A-AS1 通過競爭性結(jié)合mi R-34a-5p調(diào)控FOXP3 的表達
    3.5 討論
第4章 PRKAR2A-AS1 通過PKA通路調(diào)控FOXP3 磷酸化介導其核轉(zhuǎn)位
    4.1 前言
        4.1.1 核轉(zhuǎn)運
        4.1.2 核轉(zhuǎn)運異常與疾病
        4.1.3 FOXP3核定位及其功能
    4.2 材料
        4.2.1 菌種
        4.2.2 質(zhì)粒載體
        4.2.3 細胞系
        4.2.4 裸鼠
        4.2.5 試劑
        4.2.6 耗材
        4.2.7 儀器與設(shè)備
    4.3 方法
        4.3.1 質(zhì)粒構(gòu)建
        4.3.2 質(zhì)粒提取
        4.3.3 細胞培養(yǎng)
        4.3.4 細胞轉(zhuǎn)染
        4.3.5 Lentivirus包裝及滴度測定
        4.3.6 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞篩選
        4.3.7 RNA提取和RT
        4.3.8 QRT-PCR
        4.3.9 蛋白質(zhì)提取和BCA法濃度測定
        4.3.10 WB
        4.3.11 免疫熒光(Immunofluorescence,IF)
        4.3.12 胞核/胞質(zhì)分離
        4.3.13 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析
    4.4 結(jié)果
        4.4.1 FOXP3的亞細胞定位與胃癌的發(fā)生相關(guān)
        4.4.2 蛋白激酶A(protein kinase A,PKA)通路抑制FOXP3 的磷酸化和核轉(zhuǎn)位
        4.4.3 PRKAR2A-AS1 通過抑制PKA通路進而促進FOXP3 的磷酸化和核轉(zhuǎn)位
        4.4.4 PRKAR2A-AS1與PKR2 直接結(jié)合
    4.5 討論
第5章 結(jié)論與展望
    5.1 結(jié)論
    5.2 展望
參考文獻
致謝
附錄1 攻讀博士學位期間取得的科研成果
附錄2 攻讀博士學位期間參加的科研項目



本文編號：3787863