第一部分:HMGA1 sh RNA干擾序列的篩選目的:本部分為探討HMGA1和ILK信號通路在肝癌中的聯(lián)系,首先設(shè)計合成了3個針對HMGA1基因的sh RNA干擾序列和1個陰性對照序列。通過實(shí)時定量PCR檢測,篩選出了干擾效率最高的sh RNA序列。然后將該序列構(gòu)建成慢病毒表達(dá)載體,以達(dá)到高效穩(wěn)定的HMGA1低表達(dá)狀態(tài),從而為后續(xù)的實(shí)驗(yàn)打下良好的基礎(chǔ)。方法:HMGA1 3個sh RNA質(zhì)粒和1個陰性對照質(zhì)粒分別瞬時轉(zhuǎn)染細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后48h收獲細(xì)胞,進(jìn)行Realtime-PCR檢測HMGA1 m RNA表達(dá)水平。上述篩選得到的最佳干擾序列構(gòu)建成慢病毒干擾載體,感染細(xì)胞并于72 h收獲細(xì)胞,進(jìn)行Western blot檢測HMGA1蛋白表達(dá)。并用熒光顯微鏡觀察病毒感染效率。結(jié)果:1 HMGA1 sh RNA干擾序列的篩選Realtime PCR結(jié)果顯示:sh NC對HMGA1的m RNA表達(dá)無明顯抑制作用(P>0.05),而3個HMGA1 sh RNA干擾序列均能顯著抑制MHCC97H細(xì)胞中HMGA1 m RNA的表達(dá)水平(P<0.05),其中HMGA1-sh RNA-2對HMG...

【文章頁數(shù)】：90 頁

【學(xué)位級別】：博士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
中英文縮略詞表
前言
第一部分：HMGA1 shRNA干擾序列的篩選
    1 材料與方法
        1.1 細(xì)胞株
        1.2 HMGA1 shRNA
        1.3 主要儀器與設(shè)備
        1.4 主要試劑
        1.5 自配試劑
        1.6 實(shí)驗(yàn)方法
    2 結(jié)果
        2.1 HMGA1 shRNA干擾序列的篩選
        2.2 慢病毒LV-HMGA1-shRNA轉(zhuǎn)染效率檢測
        2.3 LV-HMGA1-shRNA對MHCC97H細(xì)胞HMGA1蛋白表達(dá)水平的抑制作用
    3.討論
第二部分：HMGA1調(diào)控了ILK/Akt/GSK-3β信號通路
    1 材料與方法
        1.1 細(xì)胞株
        1.2 質(zhì)粒
        1.3 主要儀器與設(shè)備
        1.4 主要試劑
        1.5 自配試劑
        1.6 實(shí)驗(yàn)方法
    2 結(jié)果
        2.1 HMGA1和ILK mRNA和蛋白表達(dá)水平的變化
        2.2 Western blot檢測各處理組細(xì)胞p-Akt和p-GSK-3β的表達(dá)水平
    3.討論
第三部分：HMGA1通過調(diào)控ILK/Akt/GSK-3β信號通路促進(jìn)了肝癌細(xì)胞的增殖和存活
    1 材料與方法
        1.1 細(xì)胞株
        1.2 主要儀器與設(shè)備
        1.3 主要試劑
        1.4 自配試劑
        1.5 實(shí)驗(yàn)方法
    2 結(jié)果
        2.1 各組細(xì)胞增殖活力的變化
        2.2 各組細(xì)胞凋亡水平的變化
    3 討論
第四部分：HMGA1通過調(diào)控ILK/Akt/GSK-3β信號通路促進(jìn)了肝癌細(xì)胞的侵襲和遷移
    1 材料與方法
        1.1 細(xì)胞株
        1.2 主要儀器與設(shè)備
        1.3 主要試劑
        1.4 自配試劑
        1.5 實(shí)驗(yàn)方法
    2 結(jié)果
        2.1 各組細(xì)胞侵襲能力的變化
        2.2 各組細(xì)胞遷移能力的變化
    3.討論
第五部分： cyclinD1、c-Myc、MMP2、MMP9可能是HMGA1/ILK/Akt/GSK-3β信號通路的下游效應(yīng)器
    1 材料與方法
        1.1 細(xì)胞株
        1.2 主要儀器與設(shè)備
        1.3 主要試劑
        1.4 自配試劑
        1.5 實(shí)驗(yàn)方法
    2 結(jié)果
        2.1 各組MMP2、MMP9、cyclinD1和c-Myc mRNA表達(dá)水平的變化
        2.2 各組MMP2、MMP9、cyclinD1和c-Myc蛋白表達(dá)水平的變化
    3.討論
全文總結(jié)
致謝
參考文獻(xiàn)
攻讀學(xué)位期間的研究成果
綜述
    參考文獻(xiàn)



本文編號：3787889