目的:研究miR-152和DNMTs家族成員在胃癌中的作用以及交聯(lián)對話的機制,為臨床評估胃癌的預(yù)后及尋找治療靶點提供實驗依據(jù)。方法:首先用原位雜交的方法檢測miR-152在80對胃癌組織及其相應(yīng)的癌旁正常組織中的表達情況,并采用qRT-PCR檢測胃癌組織及不同分化程度的胃癌細胞株的miR-152的表達水平。接著通過體外轉(zhuǎn)染miR-152 mimic至胃癌上皮細胞株MKN-45和HGC-27,觀察miR-152表達變化對細胞增殖能力、侵襲能力以及細胞非錨定依賴性生長能力的影響。通過免疫組化和qRT-PCR的方法檢測DNMTs在胃癌組織和細胞中的表達,以及DNMT1蛋白表達和miR-152表達之間的相關(guān)性。通過生物學信息軟件、熒光素酶報告基因預(yù)測和鑒定miR-152的靶基因。通過共同轉(zhuǎn)染miR-152和3’UTR突變型DNMT1至胃癌上皮細胞株MKN-45和HGC-27,檢測細胞中DNMT1蛋白的表達及觀察細胞增殖能力、侵襲能力和細胞非錨定依賴性生長能力的變化。結(jié)果:原位雜交和qRT-PCR結(jié)果顯示,相較于癌旁正常組織,有80%(64/80)胃癌患者的胃癌組織中miR-152表達呈低表達狀...

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【學位級別】：博士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
縮略表
前言
第一章 前期工作基礎(chǔ)
第二章 miR-152在胃癌組織和不同胃癌細胞株中的表達
    1 實驗材料
        1.1 組織標本
        1.2 細胞株
        1.3 主要實驗設(shè)備
        1.4 主要試劑
        1.5 主要試劑配制
    2 實驗方法
        2.1 原位雜交檢測
        2.2 細胞培養(yǎng)
        2.3 qRT-PCR檢測miR-152的表達
        2.4 統(tǒng)計學處理
    3 結(jié)果
        3.1 原位雜交方法檢測胃癌組織中miR-152的表達
        3.2 qRT-PCR的方法檢測胃癌組織中miR-152的表達
        3.3 miR-152在不同分化程度的胃癌細胞株中的表達
    4 結(jié)論
第三章 miR-152對人類胃癌細胞株生物行為的影響
    1 實驗材料
        1.1 細胞株
        1.2 主要實驗設(shè)備
        1.3 主要試劑
        1.4 主要試劑配制
    2 實驗方法
        2.1 細胞培養(yǎng)
        2.2 細胞轉(zhuǎn)染
        2.3 細胞中小RNA的提取和質(zhì)量判斷
        2.4 qRT-PCR檢測分析miR-152
        2.5 細胞增殖能力的檢測（MTT比色法）
        2.6 軟瓊脂集落形成實驗
        2.7 Transwell侵襲實驗
        2.8 統(tǒng)計學處理
    3 結(jié)果
        3.1 轉(zhuǎn)染效率檢測
        3.2 miR-152高表達對胃癌細胞增殖力的抑制
        3.3 miR-152高表達對胃癌細胞侵襲力的抑制
        3.4 miR-152 mimic的有效作用時間檢測
        3.5 miR-152高表達對細胞非錨定依賴性生長能力的影響
    4 結(jié)論
第四章 DNMTs家族在胃癌中的表達
    1 實驗材料
        1.1 組織標本
        1.2 主要實驗設(shè)備
        1.3 主要試劑
        1.4 主要試劑的配制
    2 實驗方法
        2.1 免疫組化檢測DNMTs在胃癌組織中的表達
        2.2 細胞培養(yǎng)
        2.3 qRT-PCR檢測DNMTs mRNA
        2.4 Werstern Blot檢測DNMTs蛋白表達
        2.5 統(tǒng)計學處理
    3 結(jié)果
        3.1 DNMTs在胃癌組織中的表達
        3.2 DNMTs在胃癌細胞中的表達
        3.3 胃癌組織中DNMT1表達與miR-152表達相關(guān)性分析
        3.4 胃癌細胞株DNMT1表達與miR-152表達相關(guān)性分析
    4 結(jié)論
第五章 miR-152和DNMT1的靶向關(guān)系分析
    1 實驗材料
        1.1 細胞株
        1.2 主要實驗設(shè)備
        1.3 主要試劑
        1.4 主要配制試劑
    2 實驗方法
        2.1 脂質(zhì)體細胞轉(zhuǎn)染
        2.2 實時熒光定量PCR檢測轉(zhuǎn)染細胞的miR-152表達水平
        2.3 qRT-PCR檢測DNMT1 mRNA
        2.4 熒光素酶報告基因載體的構(gòu)建
        2.5 雙熒光素酶報告基因分析
        2.6 Western Blot蛋白印跡
        2.7 統(tǒng)計學處理
    3 結(jié)果
        3.1 miR-152靶基因的預(yù)測
        3.2 熒光素酶報告基因分析
    4 結(jié)論
第六章 DNMT1逆轉(zhuǎn)miR-152對胃癌細胞生物行為的影響
    1 實驗材料
        1.1 細胞株
        1.2 主要實驗設(shè)備
        1.3 主要試劑
        1.4 主要試劑的配制
    2 實驗方法
        2.1 質(zhì)粒構(gòu)建
        2.2 細胞的慢病毒感染
        2.3 脂質(zhì)體細胞轉(zhuǎn)染
        2.4 轉(zhuǎn)染效率的PCR檢測
        2.5 細胞中總RNA的提取
        2.6 qRT-PCR定量分析miR-152
        2.7 qRT-PCR檢測DNMT1 mRNA
        2.8 Western Blot蛋白印跡qRT-PCR
        2.9 細胞增殖能力的檢測
        2.10 軟瓊脂集落形成實驗
        2.11 Transwell侵襲實驗
        2.12 統(tǒng)計學處理
    3 實驗結(jié)果
        3.1 轉(zhuǎn)染效率的檢測
        3.2 DNMT1 3'UTR的突變逆轉(zhuǎn)miR-152高表達對細胞增殖能力的影響
        3.3 DNMTl 3'UTR的突變逆轉(zhuǎn)miR-152高表達對細胞侵襲能力的影響
        3.4 DNMTl 3'UTR的突變逆轉(zhuǎn)miR-152高表達對細胞非錨定依賴性生長能力
    4 結(jié)論
總結(jié)
參考文獻
作者簡介及在學期間所取得的科研成果
致謝



本文編號：3778539